[发明专利]用微生物发酵制备去氢表雄酮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及甾体类药物中间体的生产方法，具体来说是用微生物发酵转化甾醇制备去氢表雄酮的方法。

背景技术

去氢表雄酮（dehyroepiandrosterone，DHEA）是一种C₁₉类固醇载体化合物，化学名称为3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮，分子式C₁₉H₂₈O₂，结构如下：

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DHEA最早于1944年从尿中分离得到，1954年发现的人硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）是人体内血浆中含量最多的皮质类固醇激素。二氢胆固醇在肾上腺皮质王状层细胞内经以细胞色素P450为主的酶系作用下转变为DHEA，DHEA经硫代激酶催化转化成DHEAS。与其它甾体类激素不同，血浆中DHEA及DHEAS随着年龄的增长浓度下降明显。而大量研究证明，DHEA是人血浆中大量共存在的肾上腺甾体化合物，具有抗炎、抗增殖及抗抑郁等活性，其衍生物在动物实验中能促进免疫应答，而且具有很好的神经保护作用。

此外，DHEA还是合成甾体药物的重要中间体，如: 甾体避孕药屈螺酮等。传统的DHEA的生产大多采用化学方法，如中国专利申请号为201210010445.9文献，采用醋酸妊娠双烯醇酮为原料，原料市场价格高昂，且分为3步化学反应完成，反应剂大多是有机溶液，且每次反应都要提纯，反应过程繁琐，对环境伤害较大。

文献中没有报道以微生物发酵来直接制备去氢表雄酮的方法。《微生物学通报》2006年33（2）中由天津大学化工学院化学工程系的张裕卿和王东青写的《植物甾醇微生物转化制备甾体药物中间体的研究进展》中提到，Dias等将从油脂脱臭溜出物中富集的植物甾醇混合物用分枝杆菌NRRL-3805处理得到4-AD和ADD；《生物加工过程》2010年9月第8卷第5期的《微生物发酵降解植物甾醇侧链生产17-酮甾体研究进展》中提到，可利用分枝杆菌NRRL B-3683和3805来转化植物甾醇生产AD和ADD；中国专利申请201210038094.2中公开了利用4-AD制备去氢表雄酮的方法。即植物甾醇先发酵生产为4-AD，然后利用化学方法得到去氢表雄酮。这是现在研究利用植物甾醇制备去氢表雄酮的方法，其存在反应路线较长，多步反应使得去氢表雄酮的生产成本较大；且由于反应的多步的，各步损耗较大，总收率较小，环保压力较大。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用微生物发酵技术直接从甾醇制备去氢表雄酮的新路径，极大的降低了去氢表雄酮的生产成本，提高了去氢表雄酮的质量收率。

本发明的技术方案是，包括如下步骤：

（1）将甾醇的3位羟基进行保护的步骤，得保护物；

（2）将保护物用菌株Mycobacterium sp. NRRL B-3683或3805进行发酵的步骤；

（3）将发酵产物进行水解的步骤；

（4）提纯的步骤。

本发明的甾醇为植物甾醇、动物甾醇或/和霉菌甾醇，优选为植物甾醇，可以为谷甾醇、麦角甾醇、豆甾醇、菜油甾醇或菜籽甾醇中的一种或多种，步骤（1）的植物甾醇可为单纯的一种，也可为多种的混合物，其物质是纯净物还是混合物并不影响反应的进行。植物甾醇之所以更适合作为发酵底物，是因为价格便宜，来源广泛，而且更适合作为底物用菌株Mycobacterium sp.NRRL B-3683或3805进行发酵。

下面是5种最主要的植物甾醇的结构式，

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本发明使用的菌株Mycobacterium sp. NRRL 3683和3805，记载在美国专利号为4755463的文献中，一般只用来进行植物甾醇到4-AD和ADD的发酵，目前普遍的研究只是通过控制反应条件如何提高4-AD和ADD的收率。

步骤（1）的目的是对3位羟基进行保护，我们在实验和文献中发现，如果不对3位羟基进行保护，菌株直接对植物甾醇进行发酵生产的话，产物将会是4-AD或ADD，达不到实验的目的，为了菌株能够对17位侧链进行专一性切除而不对3位羟基进行切除，我们实验了多种办法，包括进行菌株的特异性诱变、筛选，加入特异性的酶制剂等等，最后我们惊奇发现，如果首先对3位羟基进行保护，然后再进行发酵，其能够达到相当好的效果。为此我们实验了多种保护剂，发现采用甲缩醛的效果最好。同时，我们发现，对3位羟基进行保护后，产物的极性变小，其在植物油中的溶解度变大，有利于发酵反应的进行，增大发酵反应的效率和产品收率。

植物甾醇和甲缩醛的反应式如下：