[发明专利]草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法

权利要求书

1.草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：确定包被抗原的浓度和多克隆抗体的最适稀释倍数；

步骤2：建立竞争抑制酶联免疫检测方法，具体过程包括如下步骤：

步骤21：包被草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的酶标板得到固定于酶标板上的抗原；

步骤22：封闭去除酶标板上没有包被上草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白的部位；

步骤23：制备酶标抗体与抗原混合液；

步骤24：将酶标抗体与抗原混合液混合后与固定于酶标板上的抗原竞争结合；

步骤25：洗涤酶标板以及对底物显色；

步骤26：对酶标板的孔进行读数得到每个孔的吸光值（OD），根据读取的吸光值分别计算标准品抗原和待测样品的抑制率从而根据该抑制率计算待测样品的浓度。

2.根据权利要求1所述的草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤1中经过棋盘滴定法确定竞争抑制酶联免疫检测时酶标抗体的最适稀释倍数为1：2000，包被抗原浓度为2μg/ml，每孔滴加100μL。

3.根据权利要求1所述的草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤21中，具体操作过程为用抗原稀释液（pH为9.6的0.05M（mol/L）碳酸盐缓冲液）稀释草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白（2μg/ml/孔）成为包被液，用包被液包被96孔酶标板，每孔加入包被液体积为100μl；4℃条件下包被过夜后甩干，用洗涤液（pH为7.4的0.1M磷酸盐缓冲液中含0.05%Tween-20，PBST）洗涤三次（每次300μl/孔），每次3分钟。

4.根据权利要求1所述的草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤22中，用封闭液（pH为7.4的0.1M PBS稀释5%脱脂奶粉、0.3%牛血清白蛋白溶液）室温封闭2小时，每孔加封闭液300μl。

5.根据权利要求1所述的草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤23中，用抗原/抗体稀释液（PBST）将重组草鱼肿瘤坏死因子alpha蛋白稀释到如下浓度：0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml以及20ng/ml作为不同浓度标准品，取不同浓度标准品50μl与50μl酶标抗体（PBST溶液中按1：2000比例稀释）混匀后室温孵育2小时。对待测样品的检测：取待测样品50μl与50μl 1:2000稀释的酶标抗体混合，同样室温孵育2小时。

6.根据权利要求1所述的草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤24中，酶标板中抗原完成封闭后，甩干封闭液，并用300μl PBST洗涤三次，每次至少3分钟，然后加入步骤23中制备完成的酶标抗体与抗原混合液，每孔中加入酶标抗体与抗原混合液100μl，室温孵育至少2小时。

7.根据权利要求1所述的草鱼肿瘤坏死因子alpha的竞争抑制酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤25中，待步骤24结束后，甩干孔内液体，用300μlPBST洗涤五次，每次3分钟，然后每孔加入100l TMB底物，37℃反应20分钟后加入50μl2M硫酸（H₂SO₄）终止反应。