[发明专利]一种人载脂蛋白B100单克隆抗体及其化学发光免疫分析测定试剂盒

说明书

【技术领域】

本发明涉及识别人载脂蛋白B₁₀₀(Apo B₁₀₀)的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，学发光免疫分析定量测定(CLIA)试剂盒及其制备方法，本发明属于生物技术领域。 

【背景技术】

心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。心脑血管疾病具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高，并发症多”即“四高一多”的特点，目前，我国心脑血管疾病患者已经超过2.7亿人！每年死于心脑血管疾病近300万人，占我国每年总死亡病因的51％。而幸存下来的患者75％不同程度丧失劳动能力，心脑血管疾病已成为人类死亡病因最高的头号杀手！ 

载脂蛋白B(Apolipoprotein B，Apo B)是血浆脂蛋白中蛋白质的一种，根据氨基酸组成和分布分为B100、B48、B74、B26和B50五种亚型。载脂蛋白B₁₀₀(Apo B₁₀₀)是低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)、中密度脂蛋白(Intermediated density lipoprotein，IDL)和极低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein，VLDL)颗粒上主要的载脂蛋白，由肝脏合成，含有4563个氨基酸残基，分子量约为510KDa。 

ApoB作为动脉硬化、冠心病等的危险因子，其与动脉粥样硬化型心血管疾病之间有着密切关系，其功能之一是携带胆固醇，因此ApoB在血液中的含量可作为胆固醇等脂类的指标。患有急性心肌梗死、心脑疾病患者、动脉硬化症、高脂血症、糖尿病、慢性肾功能不全等疾病ApoB含量出现增高。 

Apo B₁₀₀与载脂蛋白AI(Apolipoprotein AI)的比值(Apo B/AI)在临床上是心脑血管疾病检测的重要指标，与心肌梗塞、缺血性中风有紧密的联系，是微蛋白尿、糖尿病和新陈代谢综合症的独立风险因子。所以Apo B₁₀₀水平的检测对疾病的早期预测有一定的意义。 

目前在临床实验室检测Apo B₁₀₀的方法主要是放射免疫分析(RIA)、免疫比浊法和酶联免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必须用放射性元素标记，检测设备复杂昂贵，其放射性元素的半衰期短，不能长期保存，检测结果不稳定，同时存在放射性污染也给实验操作人员带来了伤害；酶免疫分析法灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。 

本发明是在酶联免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，通过发光底物产生的光信号来代替酶联免疫分析中的显色底物，其灵敏度有很大的提高，本发明操作简便，适用性强，可同时大批量的检测，成本低，更易在临床诊断和实验室推广使用。 

【发明内容】

本发明的目地是建立一种简单且具高灵敏度的检测ApoB₁₀₀的方法。并将该方法应用于人类心脑血管疾病的检测。本发明获得了能够产生特异性识别ApoB₁₀₀的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株4-3-2与杂交瘤细胞株4-6-3，该细胞株已于2012年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC C201209与CCTCC C201210。此外，经过鉴定，两珠单克隆抗体分别识别ApoB₁₀₀的两个不同表位，通过4-3-2与4-6-3的结合建立了夹心酶联免疫反应方法，提供一种人载脂蛋白B₁₀₀化学发光免疫分析测定试剂盒以及该试剂盒的制备方法。利用该试剂盒分析检测灵敏度高、特异性强。 其是一种高灵敏度及高通量的检测系统。 

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案： 

1.单克隆抗体的制备方法，具体包括以下步骤： 

(1)用蛋白量为50ug的人ApoB₁₀₀与弗氏完全佐剂混合；经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再15天后进行第三次相同剂量与弗氏完全佐剂混合免疫；10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度，用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫；3天后取脾细胞进行融合； 

(2)将免疫小白鼠脾细胞与小白鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10∶1的比例，用50％PEG作为融合剂融合；