[发明专利]用于点状物体的三维定位的显微镜设备和显微镜方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于点状物体的三维定位的显微镜设备和显微镜方法。

背景技术

光学显微成像方法最近已被发展，该光学显微成像方法使得成像比通过采用单独标记(特别是荧光分子)的连续的、随机的定位的常规光学显微镜的衍射诱导的分辨率极限更小的样本结构成为可能。例如在WO 2006/127692 A2，DE 10 2006 021 317 B3，WO 2007/128434A1，U.S.2009/0134342 A1，DE 10 2008 024 568 A1，WO 2008/091296 A2，“Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy(STORM)，”Nature Methods 3，793-796(2006)，M.J.Rust，M.Bates，X.Zhuang；“Resolution of Lambda/10 in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching，”Geisler C.等，Appl.Phys.A，88，223-226(2007)中描述了这样的方法。显微术的这个新的分支也被称为定位显微术。应用的方法在文献中例如通过以下名称是已知的：(F)PALM((荧光)光活化定位显微术((fluorescence)photoactivation localization microscopy))，PALMIRA(具有独立地运行采集的PALM(PALM with independently running acquisition))，GSD(IM)(基态损耗(单独分子返回)显微术(ground state depletion(individual molecule return microscopy)))或(F)STORM((荧光)随机的光学重建显微术((fluorescence)stochastic optical reconstruction microscopy))。

这些新方法的共同之处是：待成像的样本结构的准备包括使用点状物体，点状物体通常被称为标记，点状物体具有两个可分辨的状态，即“明亮”状态和“黑暗”状态。例如，如果荧光染料被用做标记，则该明亮状态为能够发荧光的状态，且该黑暗状态为不能发荧光的状态。

在优选的特定实施例中，例如，在WO 2008/091296 A2和WO 2006/127692 A2中，使用了可光切换的(photoswitchable)或可光激活的(photoactivatable)荧光分子。可选地，如，例如，在德国审查的接受的说明书DE 10 2006 021 317 B3中的，利用标准荧光分子的固有黑暗状态。

为了以比成像光学部件的常规分辨率极限更高的分辨率使样本结构成像，标记中的小子集被重复地转换到明亮状态。这需要选择形成这个激活的子集的标记的密度，该密度将确保在明亮状态(因此在该状态下可通过光学显微术成像)中相邻的标记之间的平均距离大于成像光学部件的分辨率极限。形成激活的子集的标记被成像到空间分辨的光检测器(例如，CCD照相机)上，以便从每个点状标记记录以光斑为形式的光分布，通过光学部件的分辨率极限确定光斑的尺寸。

因此，在其他激活子集被成像中的每一个中，多数单独的原始数据图像被捕获。在每个单独的原始数据图像中，然后可在图像分析步骤中确定光分布的质心位置，该光分布表示在明亮状态中的点状标记。然后将从单独的原始数据图像中确定的光分布的质心位置以组合的图像数据记录的形式的全部表现而集合。由这个全部表现产生的高度分辨的组合图像反映标记的分布。

典型地复制待成像的样本结构需要足够数量的标记信号被检测。然而，由于在特定激活子集中标记的数量受在明亮状态中的两个标记之间的所需的最小平均相互距离限制，因此必须记录大量的单独的原始数据图像以能够完全地成像该样本结构。单独的原始数据图像的数量范围典型地为10000至100000。

在以上描述的定位显微术方法中，在光检测器上生成的单独的光斑的质心位置典型地仅在二维上确定，以便从所有质心位置重建的样本结构的高分辨图像同样地也仅是二维图像。然而，在三维上重建该样本结构是优选的。