[发明专利]昆虫细胞系的建立方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种昆虫细胞系的建立方法，属于昆虫细胞培养技术领域。

背景技术

随着生命科学的迅猛发展，作为细胞工程之一的昆虫细胞培养技术越来越受到国内外学者的重视。作为现代生物学上极有价值的手段之一，昆虫细胞培养被广泛地应用于医学、遗传学、分子生物学、生物学、生理学、病毒学、昆虫病理学及农业生产等多个领域。1915年，Richard Goldschedt首次在体外维持了昆虫组织外植体的活性。1962年，Grace成功地建立起世界上第一个昆虫细胞系——桉蚕蛾（Anteraea evcalypti）卵巢细胞系。在以后的几十年中，昆虫细胞培养成为世界上许多科学家研究的对象，特别是自Smith创建了昆虫杆状病毒表达系统（Baculovirus Expression Vector System，BEVS）以来，昆虫杆状病毒作为一种安全有效的载体，能在体外培养的昆虫细胞中高效地表达外源基因，促进了昆虫细胞培养的发展。近五十年来，由于昆虫细胞大规模培养，使昆虫杆状病毒表达系统、生物杀虫剂、抗菌肽等的研究取得了进一步发展。昆虫细胞作为昆虫生理生化研究、生物反应器以及表达基因产物等的重要研究工具，已受到越来越多的重视，不断有新的昆虫细胞系建立的报道。到目前为止，全世界建立的昆虫细胞系有800株以上，分别来源于鳞翅目、双翅目、鞘翅目、蜚蠊目、膜翅目、直翅目、同翅目和半翅目等8个目的170多种昆虫，然而其中的大部分均来自鳞翅目和双翅目，而来源于其他目的昆虫细胞系仅占1/10左右。我国已先后从鳞翅目、双翅目的十多种昆虫中得到了40多个细胞系，与国际的差距较大。相对于庞大的昆虫种类及昆虫细胞的广泛利用领域来说，昆虫细胞培养及昆虫细胞系建立的研究仍是一个值得广泛研究和深入发展的领域。相对于哺乳动物细胞培养研究的历史和现状，昆虫细胞培养技术仍然处于初始阶段，难点和问题很多，许多基本的技术和方法有待建立，需要作大量细致的研究工作。由于昆虫种类繁多，不同物种、甚至相同物种不同组织来源的细胞培养的方法、现象、规律往往大不相同。一些研究思路可以借鉴哺乳动物细胞培养的研究，但是也要注重昆虫细胞自身的特殊性。尽管现有的昆虫细胞系建立技术已经在多种昆虫种类中得到应用，但是，昆虫细胞系建立的成功率仍然较低，建系困难且耗时是首要限制因素。

发明内容

本发明的目的在于提供一种昆虫细胞系的建立方法，为昆虫生理生化研究、生物反应器以及表达基因产物等，提供技术支持和保障。

本发明通过下列技术方案完成：一种昆虫细胞系的建立方法，其特征在于经过下列步骤：

1）用质量浓度为65～80%的酒精溶液，对昆虫虫体进行灭菌处理1～5min，用无菌水洗2～4次，用滤纸吸去水份；

2）在显微镜下挑取步骤1）的昆虫放入PBS溶液进行常规清洗；

3）将步骤2）的清洗昆虫转入装有质量浓度为0.10～0.25%的胰酶溶液的1.5～2ml离心管中，将昆虫剪碎至0.5～1mm³，消化处理5～10min，得昆虫细胞悬液；

4）将步骤3）的细胞悬液吸入12.5～25cm²的培养瓶中，每瓶装入量为0.5～1ml，用改良培养基补足至4～5ml，所述每1000毫升改良培养基中含有下列组分：

Grace培养基             40～50g

海藻糖                  0.5～3g

酵母抽提物               0.5～3g

胎牛血清              100～200ml

水                          余量；

5）将步骤4）的装有细胞悬液及改良培养基的培养瓶，置于25～28℃的培养箱中，密闭无光照培养至细胞增殖并生长至铺满甁底；

（6）将步骤5）的铺满甁底的细胞进行常规悬浮并混匀后，以2:1或3:1的比例分瓶，并加入新鲜的改良培养基补充至4～5ml，继续在密闭无光照培养条件下培养至细胞增殖，如此传代培养至50代，使昆虫细胞系建立。

所述步骤4）的改良培养基中的Grace培养基为市购产品；海藻糖为市购的海藻糖Glucose产品；酵母抽提物为市购的酵母抽提物TC-Yeastolate产品；胎牛血清为市购的灭活胎牛血清，水为纯净水。