[发明专利]一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法

说明书

技术领域

一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法，属于免疫PCR领域。

背景技术

三聚氰胺(Melamine，MEL)俗称密胺、蛋白精，是一种三嗦类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料，广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。三聚氰胺对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。然而由于三聚氰胺具有很高的含氮量，食品工业常用凯氏定氮法测定氮总量来估算蛋白质的含量，因此三聚氰胺常被不法商人用作食品和饲料的添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标。2008年10月8日，卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理值:婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1.0mg/kg，液态奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg(L)。含乳15%以上的其它食品中三聚氰胺的限量值为2.5mg/kg(L)，高于以上限量值的产品一律不得销售。目前，用于三聚氰胺残留物定量检测的金标准是色谱/质谱法，但其需要复杂的样品前处理过程以及昂贵的检测费用。ELISA方法和免疫层析试纸条，所需检测时间相对短，但其检测限有限。因此，需要开发一种简单、快速、灵敏、经济的三聚氰胺检测方法。

基于抗原抗体反应的酶联免疫ELISA方法和免疫层析技术,分别以辣根过氧化物酶（HRP）和胶体金作为信号标记分子，受其灵敏度等的限制，检测含量有限。

实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）是对DNA进行扩增的一种方法，同时可以精确灵敏的定量样品中极微量的DNA的含量。因此，基于RT-qPCR超强的扩增效应以及定量分析，以DNA作为检测的标记分子，可以带来更多的优势，如：检测限低、灵敏度高、特异性好、操作简单以及高通量分析等。

抗原抗体免疫识别原理结合DNA的扩增分析，通过DNA扩增产生的荧光信号，间接测定待检目标物的含量。本方法的最大优点在于可以实现三聚氰胺飞克级的检测水平，是目前实现三聚氰胺检测灵敏度最高的一种方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA标记的免疫传感器，通过免疫识别和PT-qPCR的扩增与定量效应，通过DNA扩增产生的荧光信号对三聚氰胺进行间接检测。

本发明的技术方案：一种测定三聚氰胺的DNA标记的免疫传感器的构建方法，包括：DNA-三聚氰胺抗体偶联物的制备，三聚氰胺包被抗原包被PCR管，三聚氰胺传感器的构建；具体步骤为：

（1）DNA-三聚氰胺抗体偶联物的制备

2.5mg双异功能团偶联剂4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)溶解于200μL超纯水，取2μLSulfo-SMCC溶液用pH7.4含150mM NaCl的100mM PBS缓冲液稀释至200μL，然后取200μL 6mg/mL的三聚氰胺抗体与200μL Sulfo-SMCC稀释液进行混合，使其终体积为400μL，于室温振荡反应30min，用截留分子量为3000的超滤管对反应物进行超滤，以除去多余的偶联剂；超滤截留物用含5mM EDTA的100mM PBS缓冲液溶解并恢复其原体积400μL，取200μL上述溶解溶液用于下步反应；将200μL 4nmol 89bp的ssDNA加入到200μL的溶解溶液中，室温振荡反应30min，反应复合物用截留分子量50000的超滤管超滤，以除去未结合的DNA，此步骤超滤两次，以保证DNA被完全除去；最后截留物再用400μL含5mM EDTA的100mM PBS缓冲液溶解，得到偶联好的DNA-三聚氰胺抗体偶联物；

所述89bp的ssDNA为：

5’-SH-GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CATTAGTCCT AGACAACGTT ACTATAACGT GAATGTAATG AACCTACAAG ACCTTCCAGA TTTTTCGGC-3’；

（2）三聚氰胺包被抗原包被PCR管

首先将PCR管用50μL 0.8%的戊二醛溶液在37℃包被5h，然后用超纯水将

PCR管洗涤三次，每次5min；用50μL 8μg/mL的三聚氰胺包被抗原包被PCR管，在37℃包被2h，用pH7.2、含0.05% Tween-20、10mM PBS的PBST缓冲液洗涤，再用pH7.2、含0.4%明胶、10mM PBS封闭缓冲液于37℃封闭2h，封闭结束后用上述PBST缓冲液洗涤干净；以上洗涤步骤均洗涤3次，每次3min；