[发明专利]检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC引物和方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种同步检测分枝杆菌感染及鉴别结核分枝杆菌复合群、副结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌的五重mPCR-DHPLC方法。

背景技术

分枝杆菌属（Mycobacterium），除结核分枝杆菌复合群（包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌）和麻风分枝杆菌外，统称为非结核分枝杆菌。据目前所知，自然界中有致病性和非致病分枝杆菌共200多种。

结核病是威胁人类及动物健康的重大传染病。世界卫生组织（WHO）专门发布了全球结核控制战略，并把每年的3月24号定为世界防治结核病日。结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTC）是人及哺乳动物的结核病原菌，包括结核分枝杆菌（又称人型结核分枝杆菌，Mycobacterium tuberculosis，M.tuberculosis），牛分枝杆菌（牛型结核分枝杆菌，Mycobacterium bovis，M.bovis），卡介苗BCG（Mycobacterium bovis BCG，BCG），非洲分枝杆菌（Mycobacterium africanum，M.africanum）和田鼠分枝杆菌（Mycobacterium microti，M.microti）。其中，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌为主要的人畜结核致病菌。

与结核分枝杆菌复合群对应的是各种非结核分枝杆菌，目前已发现上百种，广泛存在于土壤、环境、动物中。临床上，各种非结核分枝杆菌感染患者的临床症状及病理变化与MTC引起的结核病极为相似，但多数非结核分枝杆菌对抗结核药物有天然耐药性；因此，鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染在临床诊疗中就有着非常重要的作用。由于非结核分枝杆菌感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性，因此准确鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌感染对动物结核病确诊也非常重要。

鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium）是人型结核分枝杆菌的近支抗酸菌，在结核分枝杆菌以外的抗酸菌中是从人分离频度最高的菌种。鸟分枝杆菌是鸟类和猪等家畜的病原，也可感染人。它是一种机会性细菌，在AIDS病人细菌感染合并症中占第一位；在抗酸菌中对化疗药物耐药性最强，并广泛存在于天然土壤和水中。

副结核分枝杆菌（Mycobacterium paratuberculosis）是引起牛、羊、羊驼等动物副结核病的病原。副结核病自1895年首次被报道后，现已广泛流行于世界各国。2002年韩国某地区调查研究显示162个奶牛场中存在副结核病流行；在我国该病分布广泛，感染率在近年有上升趋势，部分地区甚至达44.8%，严重危害着畜牧业发展。目前副结核病尚无特效治疗方法或药物。对于副结核病的控制常采用检测、隔离、淘汰病畜等方法。

2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查报告显示，我国现有活动性肺结核患者451万，菌阳性肺结核患者196万。分枝杆菌培养阳性者中，结核分枝杆菌占86.4%，牛结核分枝杆菌占2.5%，非结核分枝杆菌占11.1%。而1990年第三次全国结核病流调时非结核分枝杆菌仅占4.9%，由此可见，非结核分枝杆菌的比率较前明显增加。非结核分枝杆菌患者对大多数一线抗结核药物耐药，采用目前标准的化疗方案治疗无效。传统的分枝杆菌菌种鉴定和药敏实验方法建立在培养基础上，烦琐、费时，需1～2月时间，不能满足临床开展早期有效化疗的需要，使非结核分枝杆菌患者经长期规则化疗而疗效不佳，疗程延长，成为难治、复治患者，细菌可能在局部播散。因此，分枝杆菌的快速鉴定对结核病的早期诊断、鉴别诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。

目前国内外用于诊断分枝杆菌的检验方法，大体上可分为3类：第一类是细菌学检验方法，如染色镜检、细菌培养和动物接种等；第二类是采用免疫学方法检测结核菌的特异性抗体，如皮内变态反应、酶联免疫吸附实验（ELISA）和补体结合实验（CF）方法等；第三类是采用分子生物学检验方法，如PCR-RFLP、PCR-核酸探针、多重PCR等。