[发明专利]一种检测砷生物可利用度的微生物细胞传感器

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测水体及土壤中砷生物可利用度的微生物细胞传感器的搭建及使用。

背景技术

随着社会经济的发展，砷及其化合物的污染形势日益严峻，已被WHO评定为水体中最严重的重金属污染物之一。砷及其化合物可造成人体心血管系统、神经系统和呼吸系统等全面的危害。对砷污染环境进行合理、准确的监测是开展污染防治工作的重要前提。

目前监测和检测重金属污染物主要有两种方法：一种是物理化学分析法，如电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等，其优点是具备高检测灵敏度和高特异性，但也存在一些不足，如仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期长，最重要的一点是，传统的物理化学方法主要是对环境重金属总量进行测定，不能检测重金属的生物可利用度；另一种方法是基于生物有机体的生物传感器，其优势是可以直接反映污染物对生物有机体的毒性及影响。微生物细胞具有易操作，繁殖及生存能力强，易储存和稳定性高的特点，以微生物细胞为生物学感应元件的微生物细胞传感器可以极大简化传感器的制作过程，提高传感器的检测效率。

微生物细胞传感器的微生物细胞含有一个由特异调控蛋白基因和报告基因组成的重组质粒。当宿主细胞的生长环境中有重金属离子存在时，宿主细胞通过不同的机制吸收重金属离子。当重金属离子进入到胞内后，重组质粒或宿主染色体DNA编码的转录调控蛋白被重金属离子特异激活，与启动子绑定或从启动子上脱落，激活(“turn on”)或抑制(“turn off”)启动子的启动，进而调控下游报告基因表达，产生可检测的信号，这种信号的变化强度与重金属诱导物的浓度密切相关，转录调控蛋白对重金属离子的识别能力和绑定能力决定着微生物全细胞传感器的检测特异性和灵敏度。微生物细胞传感器已成为重金属生物可利用度监测和风险污染评价的重要工具。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的化学检测方法不能反映砷的生物可利用度且存在操作复杂、仪器价格昂贵等问题，利用大肠杆菌砷抗性操纵子ars启动子序列、调控蛋白基因arsR和商业化质粒pEGMluc的荧光素酶报告基因(luc)，构建出的一种微生物细胞传感器，从而提供一种具有高灵敏度、低成本的砷生物可利用度检测方法。

构建该细胞传感器的具体操作步骤为：

1、T7启动子和报告基因的拼接

以商业化质粒载体pRSET A.B.C为模板，PCR扩增得到T7启动子片段fl；以商业化质粒载体pGEM-luc为模板，PCR扩增得到荧光素酶报告基因luc片段f2；将片段f1和f2按一定比例混合，以混合液为模板，PCR扩增得到T7启动子和报告基因luc的拼接片段f3；

2、包含T7启动子的报告基因导入pUC18质粒：

对pUC18质粒用SacI与BamHI进行双酶切处理后纯化得到载体v1；对拼接序列f3用SacI与BamHI进行双酶切处理后纯化得到片段f4；将片段f4连入载体v1，利用大肠杆菌作为宿主进行转化，得到含有T7启动子和报告基因luc的载体v2；

3、载体v2中lac启动子的去除

以pUC18为模板，扩增得到不含lac启动子的pUC18部分序列f5；对f5用SacI和HindIII进行双酶切处理后纯化得到片段f5′；对载体v2用SacI利HindIII进行双酶切处理后纯化得到载体v3；将片段f5′连入载体v3，利用大肠杆菌作为宿主进行转化，得到含有T7启动子和报告基因luc且去除lac启动子的载体v4；

4、载体v4与T7终止子的拼接：

以pET30a为模极，扩增得到T7终止子片段f6；对片段f6用BamHI和HindIII进行双酶切处理后纯化得到片段f6′；对载体v4用BamHI和HindIII进行双酶切处理后纯化得到载体v5；将片段f6′连入载体v5，利用大肠杆菌作为宿主进行转化，得到受T7启动子诱导表达的基础型传感器细胞；

5、基础型传感器的表达能力验证：

用2mM的IPTG诱导基础型传感器细胞，采用Varioskan Flash全波长扫描多功能酶标仪检测其发射光谱以验证基础型传感器细胞对报告基因的表达能力。

6、目标质粒的构建