[发明专利]核酸探针在片延伸基因芯片及制备工艺和使用方法

说明书

技术领域

本发明主要涉及一种核酸探针在片延伸基因芯片及其制备工艺和使用方法，属于生物技术领域，特别是基因芯片领域。 

背景技术

基因芯片技术在医学、生命科学、药业、农业、环境科学等凡与生命活动有关的领域中均具有重大的应用前景。阵列型基因芯片技术可广泛应用于疾病诊断、药物基因组图谱、筛选、中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。国内外研究结果表明：传统基因芯片将寡核酸探针固定在芯片载体表面的杂交动力学表现与核酸在溶液中的表现明显不同，实验结果很难解释，甚至互相矛盾。主要原因是表观反应速率不仅与探针的密度、探针的长度、探针在互补序列上的位置、溶液扩散速度、载体表面物理性状、环境温度、离子强度及种类有关，还受其他重要因素的影响。 

科学家们发现，基因芯片杂交结果的重现性仍然不是十分理想，一般情况下，中高密度基因芯片杂交结果的重现性在85%左右。Zhang L等使用从同一标本中提取mRNA用Affymetrix公司生产的U133A Gene和U133 Plus2.0芯片进行参照杂交，杂交实验获得的结果相当不一致，两个芯片杂交结果比较，将近70%检测相同基因的探针阵列点杂交信号数值出现明显偏差，他们认为通过比 较两种芯片杂交结果，无法确定哪个结果能够准确反映生物样本中基因表达水平。利用OWLS(optical waveguide lightmode spectroscopy,OWLS)非标记检测技术，在实验过程中观测到当靶核酸序列长于探针序列时，靶序列及其与探针杂交后的游离端在溶液中会形成立体结构，而具有立体结构的靶序列分子的热力学扩散运动，不仅影响杂交体的形成，还会使杂交体的解离常数增加，甚至使杂交体不能稳定存在。靶序列分子游离端热力学运动是影响杂交动力学的重要因素。杂交结果重复性较差这一瓶颈问题限制了基因芯片技术的发展。 

前期研究发现，核酸在固液界面，尤其是当固定在芯片表面的核酸探针长度短于核酸靶序列长度情况下，杂交动力学行为有悖于Southern理论。 

为了实现核酸探针在片延伸，提高基因芯片检测的重复性和单碱基变异检测的特异性，应该构建具有PCR扩增、探针延伸、荧光标记、杂交、清洗和检测功能的核酸探针在片延伸基因芯片。采用核酸探针在片延伸技术在延伸核酸序列时，可以实现等位基因特异性PCR（allele specific PCR），针对单碱基变异（包括SNPs）进行分析。传统的基因芯片通过互补序列杂交的方式检测待检样品的核酸序列，对单碱基变异识别能力较差。如果通过改变现有基因芯片工作原理，研制核酸探针在片延伸基因芯片，可以利用等位基因特异性PCR技术原理提高基因芯片识别单碱基变异的能力。 

发明内容

发明目的 

本发明设计了一种核酸探针在片延伸基因芯片及制备工艺和使用方法，在该芯片上能够实现核酸探针在片延伸，其目地在于提供一种高通量、高重复性、高准确性的基因序列检测技术及装置。 

技术方案 

一种核酸探针在片延伸基因芯片，包括芯片本体，其特征在于：芯片本体上具有微池，芯片本体一侧为盖玻片，芯片本体与盖玻片之间设有密封圈，芯片本体上方设有压盖，芯片本体另一侧设有两个阀门，在微池的两端分别设有阀门的流入道和流出道；核酸探针微阵列固定于盖玻片内表面的微池覆盖范围内，盖玻片、密封圈与芯片本体的微池形成密闭的PCR反应室，盖玻片构成透明的一侧薄室壁。 

微池的容积为20-50μl，微池具有快速变温的薄壁结构。 

该芯片在玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中，分别固定识别不同基因序列的特异性探针和等位基因鉴别探针，同时另设有质控探针和阵列位置指示探针；利用DNA聚合酶特异性延伸的特性，在基因芯片表面进行核酸探针特异性延伸，实现完全互补核酸探针在片延伸。 

一种如上所述核酸探针在片延伸基因芯片的制备工艺，其特征在于：步骤如下： 

（1）芯片本体制备：选用热变形温度≥140℃注塑材料，制做基因芯片本体； 

（2）密封圈制备：制做环形密封圈； 

（3）设计探针和引物：从NCBI等数据库获得基因芯片设计需要的基因序列，利用生物信息学生物软件设计引物和特异性的探针；