[发明专利]酶法合成5-羟基色氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术生产氨基酸的技术领域，涉及通过色氨酸酶催化5-羟基吲哚和L-半胱氨酸合成L-5-羟基色氨酸的方法。

背景技术

5-羟基色氨酸（又名L-5-羟基色氨酸，简称5-HTP）是一种天然芳香族氨基酸，是人体内重要的神经递质5-羟色胺的前体，5-羟色胺是脑部分泌的一种荷尔蒙，会影响我们的情绪、睡眠和食欲，造成脑中的血清素不平衡时需5-HTP来维持身体处于正常状态。现代医学已经证明5-HTP具有多种明显的药理作用，包括：控制情绪、减少焦虑、治疗抑郁症；改善睡眠；减弱食欲，治疗肥胖；治疗纤维性肌痛综合征；缓解慢行头痛等症状。5-HTP已在医药和保健食品行业得到了广泛的应用。在欧美5-HTP已成为最重要的抗抑郁补剂和非处方药物。

目前，5-HTP生产方法主要包括：

（1）提取法，是从豆科植物如加纳籽（专利CN101648900）中提取。该工艺是目前5-HTP生产的主流工艺，条件稳定，产品纯度高。但是，原料加纳籽的产量和采收期决定了该工艺的生产成本，而且近年来随着非洲地区原料采收成本的逐年走高，导致5-HTP的价格居高不下。

（2）化学合成法，是以色氨酸和羟基乙酸为原料，在高压反应釜中进行化学羟化反应得到多羟基色氨酸，然后在催化剂色氨酸酶的作用下，在碱性条件下水解最终得到5-HTP。该工艺反应复杂、反应条件严格、能耗巨大，且产物5-HTP的产量不稳定，因此一直未能扩大生产。

（3）生物转化法，是以微生物细胞或从生物体中提取的酶作为生物催化剂，利用酶的专一性制备5-HTP，具有反应条件温和、反应速度快和专一性强等优点。传统的酶法是以色氨酸羟化酶作为催化剂，以色氨酸为底物，特异性地生成5-HTP。国内外已有报道对动物体内色氨酸羟化酶基因克隆并测定DNA序列和蛋白序列。继而，在CDNA文库中筛选相应的基因序列并利用成熟的质粒转化方法将该基因导入工程菌株进行大规模发酵生产，将体外获得的色氨酸羟化酶用于5-HTP生产。国内专利CN101864466利用已有报道的家兔Oryctolagus cuniculus色氨酸羟化酶基因构建重组表达载体，通过质粒转化BL21获得工程菌株，利用该菌株进一步发酵，在发酵成熟期添加底物色氨酸获得终产物5-HTP。

色氨酸酶，也称色氨酸吲哚裂和酶（tryptophanase,EC4.1.99.1），是由含有一个磷酸吡哆醛结合位点的相同亚基组成的四聚体，该四聚体在NH⁴⁺、K⁺或Rb⁺存在下具有催化活性，但活性受Na⁺和Li⁺抑制。该酶在微生物中特别是大肠杆菌中有大量存在，主要催化色氨酸厌氧分解产生吲哚、丙酮酸和氨，对半胱氨酸和丝氨酸已有一定作用。中国专利（申请号CN201010031351.0）采用重组枯草芽孢杆菌高效表达色氨酸酶，用于酶法拆分DL-半胱氨酸制备D-胱氨酸和L-色氨酸。目前，还未见该酶用于制备5-HTP的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的酶法合成5-羟基色氨酸（5-HTP）的方法，该方法以色氨酸酶为催化剂，以5-羟基吲哚和L-半胱氨酸为底物，工艺简单、环保无污染。

本发明提供的酶法合成5-羟基色氨酸（5-HTP）的方法包括：以表达色氨酸酶的大肠杆菌基因工程重组菌BL21(DE3)-pET21a(+)-tnaA的发酵菌体细胞或裂解液或枯草芽孢杆菌基因工程重组菌WB600-pWB980-tnaA的发酵液为酶源，以5-羟基吲哚和L-半胱氨酸为底物，酶促反应液中，底物5-羟基吲哚的加入量为5至20g/L，L-半胱氨酸的加入量为6至24g/L，酶源的添加量为2000至8000U/L，在40至60℃下，pH7至9，经酶法转化反应3至12h，生产5-HTP。酶促反应液中还包括辅酶磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的加入量为0.005至0.02g/L。

底物5-羟基吲哚的用量优选为15g/L，底物L-半胱氨酸的用量优选为18g/L，酶源的添加量优选为6000U/L，磷酸吡哆醛的用量优选为0.015g/L，优选转化温度为45℃，优选转化pH8，优选转化时间12h。

所述的表达色氨酸酶的枯草芽孢杆菌基因工程重组菌WB600-pWB980-tnaA来自专利CN201010011351.0。