[发明专利]一种组织工程软骨的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程领域，尤其涉及一种应用可降解人工合成膜片材料构建组织工程软骨。

背景技术

软骨是一种无血管的组织，因其自我修复能力低下，所以软骨损伤或畸形一直以来都是临床治疗的一大难题。组织工程技术为软骨缺损修复提供了一种全新的治疗手段。可降解生物支架材料是组织工程的基本要素之一，目前构建软骨常用的支架材料有聚乳酸（polyglycolicacid，PGA）、I型胶原、软骨脱细胞基质等，其中软骨脱细胞基质因其良好的细胞相容性，无免疫原性等优点而成为近年研究的热点。软骨脱细胞基质具有成分天然、力学强度与正常软骨组织相似等优点，然而由于软骨是非常致密的结缔组织，因此存在脱细胞不全和新生细胞难以长入两大障碍。为了解决上述难题，人们尝试了多种方法，但效果都不理想。但大块软骨存在脱细胞不彻底以及细胞再次长入困难等问题，同时软骨脱细胞膜片还存在制备过程复杂，不易标准化等问题。

因此，本领域迫切需要提供一种新的构建组织工程软骨的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种新的构建组织工程软骨的方法。

本发明提供了一种组织工程软骨的构建方法，所述方法包括步骤：

（1）在Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片上加软骨细胞悬液；

（2）在步骤（1）产生的软骨细胞悬液上加Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片；

（3）重复步骤（1）和（2），得到复合物；

（4）体外培养复合物得到组织工程软骨。

在另一优选例中，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片中Gelatin和PCL的重量比为90∶10-10∶90。

在另一优选例中，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片中Gelatin和PCL的重量比为70∶30-30∶70；更优选为70∶30-50∶50。

在另一优选例中，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片的横切面为直径7-12mm的圆形。

在另一优选例中，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片的厚度为10-30μm。

在另一优选例中，所述软骨细胞悬液中的软骨细胞浓度为50-150×10⁶/ml。

在另一优选例中，每次所加软骨细胞悬液为1-10μl。

在另一优选例中，步骤（3）中重复步骤（1）和（2）5-15次。

在另一优选例中，步骤（3）得到的复合物上覆盖培养液后再进行体外培养。

在另一优选例中，所述软骨细胞来自全身软骨组织。

在另一优选例中，所述全身软管组织是耳廓、肋骨、或关节等。

据此，本发明提供了一种新的构建组织工程软骨的方法。

附图说明

图1是三明治法构建软骨组织操作示意图。

图2显示了三种比例的Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜材料的大体观，电镜微观结构。

图3显示了经体外培养1w+体内培养12w的组织工程软骨大体观（A），细胞材料4h粘附率（B），体外培养1w+体内培养3w的组织工程软骨生物力学分析（C）情况。

图4显示了三种材料体内外构建组织工程软骨的组织学分析；拼图标尺为500μm，放大图片标尺为100μm。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现可以使用一定比例的Gelatin（明胶）/PCL（polycaprolactone，聚己酸丙酯）纳米纤维材料作为组织工程支架材料，并且通过“三明治法”将Gelatin/PCL纳米纤维材料（膜片形式）和软骨细胞按“膜片-细胞悬液-膜片-细胞悬液”的方式在培养皿中层层叠加所得到的复合物，经过体外培养可以有效构建组织工程软骨。

本发明提供的构建组织工程软骨的方法是将种子细胞接种于生物可降解材料上形成种子细胞-材料复合物，然后在体外培养条件下（例如在常规的含5%CO₂的37℃培养箱中）进行体外培养可以得到可用于移植的组织工程化软骨。也可以进一步地，在体外培养后植入体内使进一步地生长。在本发明的一个实施例中，是在体外培养后植入哺乳动物皮下。

在本发明提供的上述组织工程软骨的构建方法中，所使用的生物可降解材料是Gelatin/PCL电纺纳米纤维，较佳地是Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜，其中Gelatin和PCL的重量比为90∶10-10∶90，优选70∶30-30∶70，更优选70∶30-50∶50。