[发明专利]刺五加水提取物在缓解果蝇肠道炎症中的应用

说明书

技术领域

本发明是刺五加水提取物应用于缓解果蝇肠道炎症，涉及果蝇天然免疫技术领域。

背景技术

果蝇不具有获得性免疫系统，只能通过天然免疫系统对病原微生物的侵染做出快速有效的应答。肠道免疫作为天然免疫的重要组成部分，是对抗细菌、毒素、食物抗原和潜在的有害生物的生理和免疫屏障。当肠道受到外界环境刺激时，肠道上皮细胞会作出一系列的应答，如合成抗菌肽（Antibactieral peptide）和活性氧(ROS)，这些分子能杀死入侵的病原微生物，以此来维持肠道内环境的稳态。

刺五加[Acanthopanax senticosus(Rupr.et Maxim.)Harms]为五加科植物，根、茎、果实均可入药。经过研究分析其主要成份包含多种糖类、氨基酸、脂肪酸、维生素A、B1、B2及大量的胡萝卜素；另含有芝麻脂素、甾醇、香豆精、黄酮、木栓酮、非芳香性不饱和有机酸、及多种微量矿物质。有研究表明刺五加具有抗疲劳、抗衰老、抗癌、增强机体免疫力等多种作用。本发明分析刺五加水提取物对果蝇肠道免疫功能的影响，为刺五加应用于肠道免疫研究提供依据，为刺五加新的药用方向奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于揭示出刺五加水提取物能应用于缓解果蝇肠道炎症。给果蝇喂食Micrococcus luteus和Beauveria bassiana孢子两种微生物，以及表面活性剂（SDS）、盐离子（NaCl）和重金属（CuSO₄）的同时喂食刺五加水提取物，结果表明，刺五加水提取物能提高果蝇的生存率和肠道内抗菌肽的表达量，降低肠道上皮内凋亡的细胞数量，改善肠道的形态，说明刺五加能缓解果蝇肠道炎症，这为刺五加应用于肠道免疫奠定基础。

本发明所采用的技术方案包括如下步骤：

（1）刺五加提取液的制备方法

称取经过粉碎的刺五加根、果实药材各20g于200mL去离子水中，浸泡24h，加热煮沸3h后用纱布过滤，在滤渣中加入200mL去离子水再提取一次，将两次提取液混匀后浓缩至200mL，使其浓度为10%（即100mg/mL），4℃备用。

（2）果蝇培养基的配制方法

正常培养基：每200mL去离子水中加入玉米粉14.2g、琼脂1.1g、酵母粉3.3g、大豆粉1.9g、白糖17g和丙酸0.94mL。

刺五加培养基：正常培养基中的去离子水换成等体积的10%刺五加提取液。

（3）菌液的配制方法

M.luteus菌菌液：过夜培养的细菌菌液按1:100比例加入到LB液体培养基中扩大培养，37℃振荡培养14h后测其OD₆₀₀值，离心后弃上清，在收集到的菌体中加入蔗糖，用10%刺五加水提取物定容，使蔗糖浓度达到5%，M.luteus菌菌液浓度达到OD₆₀₀=180，此组为实验组；用去离子水定容的含5%蔗糖的M.luteus菌菌液（OD₆₀₀=180）为对照组，4℃备用。

真菌孢子溶液：将B.bassiana涂布到LB固体培养基上，25℃静置培养7天，用无菌的PBS收集平板上的孢子过滤后，测其浓度，配成OD₆₀₀=6的孢子溶液，4℃备用（配制方法同细菌菌液配制方法）。

（4）化学试剂的配制方法：

在10%SDS中加入蔗糖，用10%刺五加水提取物定容，使蔗糖终浓度达到5%，SDS终浓度为0.6%，此组作为实验组；用去离子水定容的含5%蔗糖的SDS（0.6%）为对照组，4℃备用。

0.4M的NaCl和6mM的CuSO₄溶液的配制方法同上。

（5）细菌和化学试剂的喂食方法

普通培养基中孵化出的果蝇作为对照组，刺五加培养基中孵化出的果蝇作为实验组，收集羽化3~4天的果蝇，随机分配雌、雄果蝇各15只，饥饿处理两小时后转移到放有5层滤纸的果蝇管中，滤纸预先加入420μL的菌液或化学试剂将其充分浸润，将浸润滤纸后多余的液体吸出。每24h更换一次滤纸，同时记录死亡果蝇的个数。

（6）肠道内抗菌肽表达量分析方法

给果蝇喂食M.luteus或B.bassiana孢子6h后分离肠道，提取总RNA，反转录成cDNA后，用半定量PCR方法检测抗菌肽的表达情况。

（7）免疫组织化学染色方法