[发明专利]均相分析物检测

说明书

本申请是2005.11.03提交的CN200580037985.4，题为“均相分析物检测”的分案申请。

技术领域

本发明涉及测定样品中分析物的存在或其浓度的方法、组合物和试剂盒。

背景技术

出于诊断和监测疾病的目的，临床化学领域需要测定生物液体中蛋白质、药物、有机体和其它分析物的浓度。例如，心肌梗塞时，（某些）蛋白质从心脏中释放出来。检测这些蛋白质的存在、浓度和其释放的时间过程可帮助诊断心脏病发作。

当前在生物液体中检测到的大多数临床相关性蛋白存在的浓度大于1皮克/毫升。例如，前列腺特异性抗原（PSA）是可用于前列腺疾病检测的血清蛋白，其在男性中存在的正常浓度约为0-4纳克/毫升。PSA水平高于4ng/ml可怀疑患有前列腺疾病，尤其是前列腺癌。用常规的免疫检测技术不难检测该浓度范围。然而，切除前列腺之后，PSA的浓度降低到用常规技术检测不到的水平。已切除前列腺的癌症患者中PSA水平增加是癌症复发的指征。需要飞克/毫升灵敏度的实验来监测这些患者。

据估计，人类大约有35,000个基因和多达500,000种蛋白质。蛋白质相对于基因的多样性增加可归因于转录后修饰（例如剪接）和翻译后修饰（例如磷酸化、糖基化）。这些修饰可显著改变蛋白质的功能。因此，即使很细微的差别也可能是临床相关性的。目前在人血浆中只鉴定了290个蛋白，虽然在2D凝胶中可看到上千个斑点。人血浆蛋白质组可能包括数以十万计的浓度极低以至现有技术难以检测到的蛋白质。目前还没有能够检测到大多数这些蛋白质的方法。

临床试验中可用的样品量相对较少增加了检测某些低浓度分析物的困难度。因此，蛋白质分析物的大多数免疫检测依赖于多相方法，例如ELISA(酶联免疫吸附测定)，其中将抗体结合的分析物与未结合的分析物物理分离。多相检测方法很复杂，并且需要多个步骤(例如，与固相结合并重复进行洗涤步骤)将结合的分析物与未结合分析物分离。这些步骤导致非特异性结合和灵敏度降低；而且这些步骤费钱费时。因此，需要避免非特异性结合的高灵敏性均相检测。

已描述了小分子如药物的均相免疫检测（不需要结合物质和游离物质的物理分离）。这些检测包括SYVA's检测、检测、酶通道免疫检测、和荧光能量转移免疫检测(FETI)(Dade Behring,Deerfield,Illinois)；酶抑制物免疫检测(Hoffman LaRoche和Abbott Laboratories):荧光偏振免疫检测(Dandlicker)，以及其它检测方法。所有这些方法的灵敏度都有限，只有少数几种方法，包括FETI和酶通道检测，适于大的多表位分析物。因此，需要用于检测生物和临床样品中存在的大的和/或复杂的分析物的灵敏的均相方法。

发明概述

本发明提供具有第一结合成员和第二结合成员的结合对，所述第一结合成员包含偶联于第一核酸的第一特异性分子，所述第二结合成员包含偶联于第二核酸的第二特异性分子，其中第一和第二核酸形成具有确定和有限的稳定性的双链体（duplex）。

在某些实施方式中，第一和第二特异性分子可以是受体、配体或抗体。特异性分子可彼此相同或不同。在一个实施方式中，本发明特异性分子与同一细胞上的两种受体相互作用。在另一个实施方式中，第一和第二特异性分子均为单克隆抗体，它们可与相同抗原上不同的表位相互作用并因此包含夹心对。

结合对的第一和第二核酸通常是单链核酸，可以是DNA、RNA或PNA，但也可以是部分双链核酸或其类似物。在本发明某些实施方式中，至少一种核酸是嵌合DNA/RNA分子。本发明的核酸可通过其5'端或3'端偶联。在本发明一方面，结合对中的一条核酸通过其5'端偶联，另一条核酸通过其3'端偶联。核酸间的双链体可在核酸的末端之间形成，或可包含中间核酸序列。在优选实施方式中，核酸适于用PCR、LCR、SDA或TMA扩增。

本发明还提供用结合成员检测分析物的方法。根据一个实施方式，将如上所述的结合对与分析物接触形成复合物。然后结合对核酸解离，然后再结合。重新形成的双链体（主要在分析物结合的结合对中发现）经3'延伸之后，通过可通过PCR扩增包含双链体的核酸来检测重新形成的双链体。当PCR引物只结合于通过重新形成的双链体的3'延伸而产生的位点而不与结合成员本身的核酸结合时，可大大减少背景。

可用多种方法中的任意一种检测扩增产物，这些方法包括溴化乙啶染色、银染、放射自显影、斑点印迹、狭线印迹、southern印迹、以及掺入荧光分子、荧光淬灭分子、化学发光化合物、化学发光淬灭分子、生物发光化合物或荧光核苷。