[发明专利]柑橘黄龙病亚洲种病原检测试纸

说明书

技术领域

本发明属于农学门类，植物保护学科，具体涉及柑橘黄龙病亚洲种病原检测试纸。

背景技术

柑橘黄龙病是世界柑橘生产上一种毁灭性病害，被各个国家列入检疫性病害。引起该病害的病原是一种称为韧皮部杆菌的限韧皮部生长的内生细菌（Cadidatus Liberibacter sp.）。目前已经知道柑橘黄龙病有亚洲种（Candidatus Liberibacter assiaticus）、非洲种(Candidatus Liberibacter africanus)和美洲种（Candidatus Liberibacter amerinus）三个种。在中国发生的黄龙病是由亚洲种病原引起的。

柑橘黄龙病可以通过接穗、苗木和介体木虱（亚洲木虱，Diaphorina citri，非洲木虱，Trioza erytreae）传播。黄龙病病原菌在自然界的寄主植物种类较多，能侵染各类柑橘品种包括宽皮橘类、橙类、柚类、柠檬类等品种，目前未发现免疫品种。柑橘木虱的其它寄主还包括九里香（Murraya paniculata）、黄皮（Clansena lansium）等13种芸香科植物。由于至今还没有根治柑橘黄龙病的技术方法，综合防控是目前防止黄龙病蔓延的主要和比较有效的方法。即：消除病源，及时铲除果园黄龙病病株和扑杀木虱。准确诊断、及时销毁黄龙病病株，是综合防控成功的关键技术之一（刘利华等， 2010；Bové, 2006）。

目前柑橘黄龙病病原菌的检测方法主要有：病叶组织超薄切片电镜下检查病原菌的方法、单克隆和多克隆抗体的免疫学方法（如ELISA），以及PCR等分子生物学检测方法等（Garnier M., 1991；Gao S，et al., 1993；李德望，1992；田亚南等，1998）。

超薄切片技术和电镜黄龙病病原菌检查的方法虽然可靠,但是该方法样品制备过程复杂，需要一般实验室不具有的超薄切片机、透射电子显微镜等精密仪器，而且病原检出率不高。单克隆和多克隆抗体等免疫学检测方法，根据已报道的研究结果，这些方法存在不同寄主和不同地域病原的专化性等问题。 PCR方法是目前实验室广泛用于检测黄龙病病原的技术，但是检测样品量也十分有限，一般每人每天能够检测10个样品，检测结果最快需要2天才能够获得。检测黄龙病病原菌的电镜方法、免疫学方法和PCR方法，都需要专业人员在实验室借助仪器设备才能够完成。

除上所述黄龙病病原菌检测方法外，还有根据柑橘病树症状进行黄龙病诊断的方法、包括田间症状诊断和指示植物诊断方法等。果园管理不良、营养缺乏（如缺乏镁、锌等元素），或其它病虫害的侵入，如柑橘碎叶病、衰退病、虫害（如星天牛）、线虫等因素也会引起柑橘植株叶片表现黄化症状，或者因为黄龙病病原与其他病原的混合侵入等导致叶片黄化。因此田间症状诊断方法不但需要有黄龙病经验丰富的专业人员，也容易出现错误诊断。指示植物诊断方法周期太长，是早期黄龙病病害诊断的方法，现在已经不用于黄龙病的诊断。

综上所述，目前的柑橘黄龙病病原检测，包括免疫学、电镜和分子生物学等方法都需要专业人员在实验室利用验仪器设备才能够完成。这些方法难以满足柑橘果园黄龙病监测的需要。

本发明就是针对柑橘黄龙病大量样品检测的需求，提供一种方便快捷、特异性高的检测产品。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了柑橘黄龙病亚洲种病原检测试纸。

本发明目的通过以下措施来实现：  

一、柑橘黄龙病亚洲种病原检测试纸的制备：通过从带有柑橘黄龙病亚洲种病原抗原的长春花寄主提取和纯化病原菌抗原，用于注射免疫兔子获得黄龙病亚洲种病原特异抗血清，纯化得到柑橘黄龙病亚洲种病原抗体，制备免疫胶体金，进而制备浸泡有免疫胶体金的结合垫、喷有检测线T-柑橘黄龙病亚洲种病原抗体和质量控制线C-羊抗兔抗体的层析膜，然后组装检测试纸产品。

如图1所示（检测试纸结构示意图），在PVC胶版上依次黏贴层析膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水材料，从而组装成柑橘黄龙病病原亚洲种病原检测试纸条。

层析膜如硝酸纤维素NC180膜，胶体金结合垫如聚酯纤维膜KL20，样品垫如SB08。

二、柑橘黄龙病亚洲种病原的检测与黄龙病的诊断，通过采集疑似柑橘黄龙病病株的病叶，加水研磨后，将检测试纸条的样品端插入研磨液，显示出2条红色条带的为黄龙病病株。

检测方法具体操作如下：

（1）柑橘黄龙病检测样品的制备