[发明专利]一种对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法

权利要求书

1.一种对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，该合成方法包括：

以溴氰菊酯为原料，通过硝化还原两步反应合成溴氰菊酯化合物；

通过重氮化反应，合成半抗原Hp-1；

利用活泼酯法将合成的溴氰菊酯半抗原Hp-1与载体蛋白BSA相偶联，制备溴氰菊酯人工免疫抗原。

2.如权利要求1所述的对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，以溴氰菊酯为原料，通过硝化还原两步反应合成溴氰菊酯化合物，合成步骤如下：

向150mL的三口烧瓶中加入溴氰菊酯18g，23mL氯仿搅拌溶解，溶液呈透明黄色，取发烟硝酸10.21mL与16mL乙酸置于恒压滴液漏斗中充分混匀，缓慢向反应瓶中滴加，1.5h滴加完毕，反应液控制在25℃-30℃范围内，待滴加完毕，保持该条件继续搅拌反应3.5h；将反应液倒入200mL的冰水中，搅拌，出现大量淡黄色粘稠物质；用乙酸乙酯对水液进行萃取，然后再用蒸馏水反复洗涤多次，收集有机相，无水Na₂SO₄干燥过夜，抽滤，减压蒸馏得金黄色粘稠液体。粗产物未经纯化，直接进行下一步反应；

称取上一步得到的产物5g，溶于装有50mL乙醇的烧瓶中，加入9.8gSnCl₂·2H₂O，搅拌得白色的浊液，反应体系用N₂保护，70℃-75℃下反应35min。反应液冷却后，倒入150mL H₂O中，搅拌，乳白色浆状，加入200mL乙酸乙酯，并用10％的NaHCO₃溶液调节pH＝7，过程中溶液产生大量的气泡，随后加入适量的硅藻土，抽滤，再用蒸馏水和乙酸乙酯洗涤滤饼，收集滤液中的有机相，无水Na₂SO₄干燥，溶液逐渐由黄色变为红棕色溶液，抽滤，减压蒸馏除去溶剂得红褐色的油状物。粗产物通过硅胶柱层析，乙酸乙酯/石油醚＝1∶2，脱色纯化得 淡黄色粘稠物，下一步进行重氮化反应。

3.如权利要求1所述的对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，通过重氮化反应，合成半抗原Hp-1，合成步骤如下：

在半抗原Hp-1的基础上引入羧基活性基团，并加入连接臂；

取上步反应产物溶于盐酸中，在冰冷却下保持温度在0-5℃之间，然后在搅拌情况下逐渐加入亚硝酸那溶液；反应时，酸的用量为产物量的3倍，反应式为：

Ar-NH₂+2HCL+NaNO₂＝ArN₂CL+NaCL+2H₂O

重氮化反应后，取上步产物0.4g，加4mol/L的HCL溶液0.1925mL，15min后加入0.5mol/L的NaNO₂溶液1.54mL，反应45min，得淡黄色液体。后加入丁二酸酐1.155g，反应2h以上，反应处于室温中磁力搅拌下进行，过夜后结束反应；反应液经减压蒸馏除去溶剂，残留固体用四氢呋喃处理，硅胶柱分离纯化，薄层硅胶板上表现为一个斑点乙酸乙酯∶石油醚＝4∶1，Rf＝0.65。

4.如权利要求1所述的对丁二单酰氧溴氰菊酯半抗原合成方法，其特征在于，利用活泼酯法将合成的溴氰菊酯半抗原Hp-1与载体蛋白BSA相偶联，制备溴氰菊酯人工免疫抗原，具体步骤如下：

称取0.31g半抗原Hp-1，再称取0.131g NHS加到半抗原中，用400uLDMF溶解于反应装置中，反应在磁力搅拌下室内温度进行10h；反应终液置4℃冰箱冷却2h以上，经1.2万rpm离心5分钟，取上清，即活泼酯液，并缓慢滴加到5mL6mg/mL的BSA溶液中反应；反应缓冲液为0.2mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液，反应在磁力搅拌下室内温度进行4小时；将反应终液置透析袋内，于0.01mol/L pH7.4的PBS溶液中4℃搅拌透析，每4-8小时换一次透析液，共透析3天，透析结束后将透析袋中的蛋白溶液，即为溴氰菊酯人工抗原Hp-1-BSA，分成若干等份分装于1ml离心管中，于-20℃冰箱中存放备用。