[发明专利]一种基于强度差分的三维超分辨显微方法和装置

说明书

技术领域

本发明属于光学显微领域，特别涉及一种基于强度差分的三维超分辨显微方法和装置。

背景技术

常规光学显微镜的分辨率由于受到光学衍射极限的影响，一般很难小于200nm，因此无法对纳米量级的样品进行观测，从而限制了其在纳米技术和生物技术中的应用。

近年来，为了突破光学衍射极限的限制，研究人员们提出了多种超分辨显微方法，包括：

受激发射损耗显微术(STED：Stimulated Emission Depletion Microscopy)：利用荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系，并通过限制受激辐射衰减的区域，减少荧光光斑大小，获得小于衍射极限的发光点来提高系统分辨率，从而突破远场光学显微术的衍射极限分辨力限制来实现无接触三维成像；

结构光照明显微术(SIM：Structured Illumination Microscopy)：将多重相互衍射的光束照射到样品上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息，通过衍射放大作用，得到清晰的超分辨图像；

光激活定位显微术(PALM：Photoactivated localization Microscopy)：采用光敏蛋白质标记样品，并且用超低光强的激活光使得每次只有极少数的光敏蛋白质被敏化，因此只有极少数的光敏蛋白被激发发射荧光。记录单个荧光分子所发出的光子直至漂白并通过PSF数字化计算出中心位置。反复这一过程逐个获取样品上所有荧光分子的中心位置，最后叠加重构成一幅完整的图像；

以及随机光场重建显微术(STORM：Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)：与PALM基本原理类似，利用荧光分子的随机逐个激发发射荧光光子，通过PSF的数字化获得其中心位置。

以上几种方法均已被实验证明可以在远场实现超衍射极限的空间分辨率，但是各自都还存在着不足。STED和SIM对系统设备的要求很高，系统的造价非常昂贵；STORM和PALM的成像速度还比较慢，无法满足实时检测的需求。

发明内容

本发明提供了一种基于强度差分的三维超分辨显微方法和装置，可以在远场实现超衍射极限的横向和轴向分辨率。该种方法和装置具有成像速度快、装置简单、信噪比好等特点，可以很好地应用于荧光及非荧光样品的检测之中。

一种基于强度差分的三维超分辨显微方法，包括以下步骤：

1)控制第一光源处于开启状态，第二光源和第三光源处于关闭状态，所述第一光源发出的第一工作光束准直后转换为第一线偏振光；

2)将所述第一线偏振光进行光路偏转，偏转后的第一线偏振光经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上，以实现对待测样品的扫描；

3)在扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第一信号光强I₁(x，y，z)，其中x，y，z为扫描点的三维坐标，并生成相应的图像；

4)控制第一光源处于关闭状态，第二光源和第三光源处于开启状态，所述第二光源和第三光源发出第二工作光束和第三工作光束分别准直后转换为第二线偏振光和第三线偏振光；

5)将所述第二线偏振光和第三线偏振光经位相调制后分别转换为第一调制光束和第二调制光束；

6)对所述第一调制光束和第二调制光束进行光路偏转，偏转后的第一调制光束和第二调制光束经聚焦和准直后转换为相应的圆偏振光投射到待测样品上，以实现对步骤3)中的扫描点的二次扫描；；

7)在扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第二信号光强I₂(x，y，z)，其中x，y，z为扫描点的三维坐标，并生成相应的图像；

8)根据公式I(x，y，z)＝I₁(x，y，z)-γI₂(x，y，z)计算有效信号光强I(x，y，z)，并利用I(x，y，z)得到超分辨图像。

当待测样品为荧光样品时，所述信号光为所述照明光斑在样品上激发出的荧光；当待测样品为非荧光样品时，所述信号光为所述照明光斑经样品表面反射的光束。

对所述第二线偏振光进行位相调制的调制函数为：

式中：ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

对所述第三线偏振光进行位相调制的调制函数为：