[发明专利]一种细胞肿大病毒DNA疫苗及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种细胞肿大病毒DNA疫苗及其构建和应用。

背景技术

细胞肿大病毒(Megalocytivirus)隶属于虹彩病毒科，是该科中三个鱼类病毒中的一种。虹彩病毒（包括细胞肿大病毒）是大型双链DNA病毒，具有二十面体衣壳。其中细胞肿大病毒近年来在东亚及欧洲流行，感染多种硬骨鱼类，给养殖渔业带来极大灾害。在我国，已报导受细胞肿大病毒危害的养殖鱼种包括石斑鱼、大菱鲆、鳜鱼、真鲷等。目前对细胞肿大病毒病的防治没有有效的方法。

DNA疫苗是一种基因疫苗，其构建原理是将疫苗抗原基因克隆于一个真核表达载体，将该载体导入受免动物后疫苗抗原在机体内表达，从而诱发保护性免疫应答。较之于其它形式的疫苗，DNA疫苗的优点是无毒性、稳定性高、可长期储存以及既能诱发体液免疫也能诱发细胞免疫。这些特点使得DNA疫苗具有良好的应用和发展前景。

发明内容

本发明目的在于提供一种细胞肿大病毒DNA疫苗及其构建和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种细胞肿大病毒DNA疫苗,以细胞肿大病毒ORF13序列为抗原基因克隆至真核表达载体，表达诱发即为质粒pCN13DNA疫苗。

具体为：步骤1）以细胞肿大病毒为模板，采用F1和R1为引物进行PCR扩增,PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接2－4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后于LB固体培养基上培养18－24小时，转化子提取质粒，即为质粒pBS13；

步骤2）将质粒pCN3用Sma I酶切，回收5.4kb片段，同时将pBS13用EcoRV酶切回收0.3kb片段；将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化大肠杆菌DH5α后于LB固体培养基上培养18－24小时，转化子提取质粒，即为DNA疫苗质粒pCN13。

所述引物F1为5′-GATATCGCCACCATGGACTATATTGCTGAGC-3′；R1为5′-GATATCTTGTGTTTTATAATACAGCTTG-3′。

细胞肿大病毒DNA疫苗的应用,所述DNA疫苗在制备预防或治疗细胞肿大病毒药物中的应用。

本发明具有如下优点：

1.高保护率。本发明的疫苗对细胞肿大病毒的免疫保护效率达70％以上。

2.长效。本发明的疫苗的保护效应可持续至少两个月。

3.安全。本发明的疫苗没有任何细胞毒性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的无内毒素质粒提取试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001）；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。

实施例1：细胞肿大病毒DNA疫苗的构建方法。

本发明的DNA疫苗基于一个细胞肿大病毒基因，即ORF13（Lu L,Zhou S,Chen C,Weng S,Chan S,and He JG.Complete genome sequence analysis of an iridovirus isolated from the orange-spotted grouper,Epinephelus coioides.Virology 2005;339:81-100）。

步骤1)DNA疫苗质粒pCN13的构建方法以及DNA疫苗制备液的制备：