[发明专利]PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法。

背景技术：

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LMO)，简称单增李斯特菌，是一种重要的食源性致病菌，能引起人和动物的李斯特菌病，临床表现为人和动物脑膜炎，败血症及孕妇流产、热性胃肠炎等，且死亡率极高，可达30%以上。随着分子生物学的发展，已有用普通PCR或荧光PCR检测VP的报道，虽然这些方法可达到快速、高通量的目的，但却无法获得分子诊断的黄金标准-基因序列，因此有出现假阳性的可能。焦磷酸测序（pyrosequencing）技术是近年来发明的一项实时地进行短片段DNA测序技术，该技术在DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记，直接测定测序引物后面的碱基序列，通过提供可靠的序列信息来确认PCR产物，同时由于主要分析PCR产物双链中的一条链的序列，避免了由于DNA链的二级结构造成的人工假象，使测序结果更加准确。

发明内容：

本发明的目的是提供简便、快捷、准确性高、特异性强的PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法。

本发明根据单增李斯特菌LMO溶血素基因hly(GenBank:DQ054589)，设计扩增引物和测序引物，建立了结合PCR-焦磷酸测序检测LMO的方法，达到从DNA碱基序列水平上快速、准确检测单增李斯特菌LMO的目的，从而实现了本发明的目的。

本发明的PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物，其特征在于，包括PCR引物和测序引物：

PCR引物：上游引物F：AGTATACCACGGAGATGCAGTGA；（如SEQ ID NO.1所示）

         下游引物R：GGCAAATCAATGCTGAGTGTT；（如SEQ ID NO.2所示）

测序引物S：AATTTCGAGCCTAACCT（如SEQ ID NO.3所示）。

本发明的第二个目的是提供PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测试剂盒，包括DNA提取试剂，PCR反应试剂，单链模板制备试剂，焦磷酸测序试剂，PCR引物和测序引物，其特征在于，所述的PCR引物和测序引物为：

PCR引物：上游引物F：AGTATACCACGGAGATGCAGTGA；（如SEQ ID NO.1所示）

         下游引物R：GGCAAATCAATGCTGAGTGTT；（如SEQ ID NO.2所示）

测序引物S：AATTTCGAGCCTAACCT（如SEQ ID NO.3所示）。

本发明的第三个目的是提供非诊断目的的PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；

（2）使用上述PCR引物进行PCR反应，回收PCR产物，制备单链模版，然后应用上述测序引物对PCR产物进行焦磷酸测序，自测序引物3^/端后的第一个碱基开始测序，测序引物后的21个DNA碱基序列为ATCCAGGTGCTCTCGTAAAAG时，判断样品中含有单增李斯特菌。

优选，所述的PCR反应，其扩增体系50μL，PCR Mix Buffer 25μl，Taq酶5μl，MgCl₂ 1μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板1μl，去离子水14μl，所述的PCR反应条件为预变性95℃4min；95℃15s，65℃30s,，72℃30s，43个循环；72℃12min。