[发明专利]乙醇酸的酶促生产

权利要求书

1.一种由乙醇腈生产乙醇酸的方法，包括：

a)将适合的含水反应混合物中的乙醇腈与包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化剂接触，由此产生乙醇酸，所述多肽如SEQ ID NO: 18所示；和

b)以盐或酸的形式回收(a)中产生的乙醇酸；其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化剂提供了至少1.5倍腈水解酶活性增加。

2.权利要求1的方法，其中酶催化剂是当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性提供了至少约2倍腈水解酶活性改善的改良的腈水解酶催化剂。

3.权利要求1的方法，其中酶催化剂是当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性提供了至少约4倍腈水解酶活性改善的改良的腈水解酶催化剂。

4.权利要求1的方法，其中酶催化剂以完整的微生物细胞、透化处理的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种成分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式存在。

5.权利要求4的方法，其中所述完整的微生物细胞是重组表达所述多肽的转化的微生物宿主细胞。

6.权利要求4的方法，其中转化的微生物宿主细胞选自：丛毛单胞菌、棒状杆菌、短杆菌、红球菌、固氮菌、柠檬酸杆菌、肠杆菌、梭状芽孢杆菌、克雷白氏杆菌、沙门氏菌、乳酸杆菌、曲霉、糖酵母、接合酵母、毕赤酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、汉森氏酵母、杜氏藻、德巴利氏酵母、毛霉菌、球拟酵母、甲基杆菌、芽孢杆菌、埃希氏杆菌、假单胞菌、根瘤菌和链霉菌。

7.权利要求6的方法，其中转化的微生物宿主细胞是大肠杆菌。

8.权利要求7的方法，其中转化的微生物宿主细胞是选自大肠杆菌MG1655和大肠杆菌FM5的大肠杆菌菌株。

9.权利要求1-8任一项的方法，其中酶催化剂固定在可溶性或不溶性的支持物中或支持物上。

10.权利要求1的方法，其中在含水反应混合物中产生的乙醇酸铵的浓度为约0.02 wt %至约90 wt %。

11.权利要求10的方法，其中在含水反应混合物中产生的乙醇酸铵的浓度为约0.02 wt %至约40 wt %。

12.权利要求9的方法，其中含水反应混合物中乙醇腈的浓度为约5 mM至约1 M。

13.权利要求12的方法，其中通过连续或等分物添加保持含水反应混合物中的乙醇腈浓度。

14.权利要求1的方法，其中含水反应混合物中pH保持在约5.5至约7.7。

15.权利要求1的方法，其中在基本上无氧的条件下进行乙醇腈酶促转化为乙醇酸。

16.权利要求1的方法，其中含水反应混合物进一步包含小于5 wt %浓度的选自硫代硫酸钾和连二亚硫酸钠的稳定剂。

17.权利要求1的方法，其中酶催化剂是再循环的酶催化剂。

18.权利要求1的方法，其中酶催化剂提供了每克酶催化剂细胞干重产生至少300克乙醇酸的催化剂生产率。

19.权利要求18的方法，其中酶催化剂提供了每克酶催化剂细胞干重产生至少450克乙醇酸的催化剂生产率。

20.权利要求19的方法，其中酶催化剂提供了每克酶催化剂细胞干重产生至少1000克乙醇酸的催化剂生产率。