[发明专利]一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，具体的说是涉及一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法。

背景技术

羊膜和绒毛膜是人胎盘的两个主要组成部分。羊膜在胎盘的最内层，膜体光滑，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性，其含有丰富的具有多潜能性、移植后不会诱导免疫排斥反的多能干细胞，人胎盘羊膜细胞还可表达神经细胞特异标记，分泌神经营养因子，用于神经系统疾病，除此之外人胎盘羊膜还可以作为眼科手术的基底膜；而绒毛膜是胎盘主体部分，与羊膜相邻，绒毛膜上同样含有丰富的具有多分化潜能的干细胞，可应用于由于衰老和病变引起的组织器官损伤修复以及移植中。

理想化的工程化组织，除了需要具备很高的生物活性外，还需要能随时满足移植等手术的需要，因此，如人胎盘羊膜和绒毛膜这样含有多能干细胞的工程化组织就需要长期保存。低温冷冻保存是活体组织保存的常用方法，它一般是在0～-196℃进行保存。尽管低温冷冻技术能够使工程化组织长期保存，但是也带来了冷冻损伤的问题。为了减少冷冻损伤的问题，在保存细胞和组织的时候需要加入冷冻保护液，从而减轻或避免冷却、复苏过程中的冰晶对细胞的损伤。

中国专利申请号201010528721.1的专利提供了一种“人脐带华通氏胶组织块冻存保护液”，其根据所要保护的间充质干细胞的特点，公开了由渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂以及基础液等等多种成分组成保护液，应对间充质干细胞在冷冻保存中可能出现的损伤情况。但是，目前尚未有针对人胎盘羊膜和绒毛膜的低温冷冻保存技术报道。因此，提供一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的技术，无疑会提高羊膜和绒毛膜的保存质量，保证羊膜和绒毛膜干细胞临床应用的效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种冷冻保护液以及冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法，使得所述方法能够有效保护人胎盘羊膜和绒毛膜，使其复苏后的干细胞活性达到90%以上。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种冷冻保护液，由胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40组成，所述胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40的体积比为7-9:1:1。

其中，作为优选，所述胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40的体积比为8:1:1。

二甲基亚砜（DMSO）是一种重要的渗透型细胞保护剂。在深低温（零下196度）保存细胞时冻存过程中，能防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。而右旋糖酐40属于非渗透性抗冻剂，能溶于水，但不能进入细胞，使溶液呈过冷状态，可在特定温度下降低溶质浓度，从而起到保护作用。由于其分子量大，分子浓度低，对溶剂的活性作用很小，能降低溶液中低分子溶质（电解质）浓度，减轻盐损伤，慢速冷冻效果较好。冻存细胞是个缓慢的过程，胎牛血清给冻存细胞提供必要的营养，而且血清中含有丰富的蛋白质对细胞也有保护作用。

胎牛血清、右旋糖酐40与DMSO按照本发明所述比例混合作为人胎盘羊膜和绒毛膜冻存时的保护液，右旋糖酐40是细胞外防护剂，DMSO具有高渗透性，是细胞内保护剂，胎牛血清是营养物质，三者适应于羊膜干细胞和绒毛膜干细胞的特性，协同保护细胞的活性，防止细胞在冻存和复苏的时候形成冰晶，进而影响细胞的活性。因此，本发明所书冷冻保护液能够应用在低温冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜中。

此外，本发明还提供一种冷冻保存人胎盘羊膜和绒毛膜的方法，以胎牛血清：二甲基亚砜：右旋糖酐40为7-9:1∶1的体积比称量胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40，配制成冷冻保护液，待储存的人胎盘羊膜和绒毛膜分别浸入到冷冻保护液中，然后降温至-100℃，最后转移至液氮中保存。

作为优选，所述胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐40的体积比为8:1:1，

所述降温操作优选为：

先以1℃/min的速率降至-40℃，然后再以5℃/min的速率降温。

将按照本发明所述方法冻存过的人胎盘羊膜和绒毛膜进行复苏，然后分离、培养干细胞，同利用新采集的人胎盘羊膜和绒毛膜制备的干细胞进行活性对比，两者活性均在90%，无明显差异，表明了本发明所述冷冻保护液和方法能够极其有效的保护羊膜和绒毛膜细胞活性，细胞几乎没有受到冷冻损伤，与新制备的羊膜和绒毛膜干细胞无差别。