[发明专利]分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的制备和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及分离来自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的制备与用途，具体涉及从草甘膦污染土壤微生物群体DNA库中分离的具有草甘膦耐受性的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSP合酶)基因及其蛋白产物的制备与用途。

背景技术

草甘膦(Glyphosate)为内吸传导型、广谱灭生性除草剂，其作用机制是通过抑制植物体内5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶(EPSPS)活性，阻断植物体内芳香族氨基酸的生物合成，导致植物死亡。

应用化学诱变细菌产生的aroA突变体，抗药性机理研究确证了aroA基因是草甘膦作用靶标EPSP合酶的编码基因。近年来包括美国和中国在内的国家，草甘膦产量急剧增加还与系列转基因抗草甘膦作物品种的选育和大面积推广有直接的关系。美国Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的编码基因及其抗草甘膦转基因植物等方面已申请了100余份专利，获得转基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等系列作物品种，其中大豆等多种转基因作物已进入商品化生产。

抗草甘膦转基因植物的研究开发对农业发展可起到巨大推进作用，因此，为选育新的高抗草甘膦的转基因作物本领域迫切需要开发新的具有抗草甘膦用途的5-烯醇式丙酮莽草酰-3-磷酸合酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种可提高植物草甘膦抗性的EPSP合酶及其编码序列的制备和用途，本发明通过从草甘膦极端污染环境中采集土壤样品，构建草甘膦污染土壤微生物群落水平DNA库，分离获得了一种EPSP合酶，并且通过实验证实了它具有高抗草甘膦抗性，并且转入植物后，可导致植物抗草甘膦抗性的提高。

本发明通过如下技术方案实现：

一种分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，用于提高植物对草甘膦的抗性。

分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶包含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶为如下多肽，

(a)具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽。

分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，高抗草甘膦EPSP合酶的酶活性为25.57U/mg。

分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，编码所述高抗草甘膦EPSP合酶的多核苷酸序列选自下组：(a)编码上述EPSP合酶多肽的SEQ ID NO:1的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶及其编码序列的用途，所述编码EPSP合酶多肽的SEQ ID NO:1的多核苷酸序列选自下组的一种:

(a)  具有SEQ ID NO: 1中1-1335位的序列;

(b) 具有SEQ ID NO: 1中1-1338位的序列。

一种用于提高植物对草甘膦的抗性的载体，含有如上所述的多核苷酸。

一种用于提高植物对草甘膦的抗性的宿主细胞，含有如上所述的载体。

分离自土壤的高抗草甘膦EPSP合酶的制备方法，(a)培养上述含有如权利要求7所述的多核苷酸的载体转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有活性的多肽。

一种能与如上所述的高抗草甘膦EPSP合酶特异性结合的抗体。

一种改变植物抗草甘膦抗性的方法，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有EPSP合酶DNA编码序列，所述的EPSP合酶选自下组：

(a)具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个到二十个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和EPSP合酶活性的由(a)衍生的多肽；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使EPSP合酶DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入EPSP合酶DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。