[发明专利]一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及改造大肠杆菌遗传组基因领域，确切地说是一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法。

背景技术

近年来，重组蛋白药物市场发展迅猛，已成为一个重要的高新技术产业。其中重要的市场重组蛋白药物主要有：人甲状旁腺激素，B淋巴细胞刺激因子，人表皮生长因子，γ－干扰素，溶血酶素及各种抗体等。在各种重组蛋白的生产中，大肠杆菌仍然是使用最广泛的宿主系统。在大肠杆菌宿主系统中，根据重组蛋白合成后的空间定位，可分为胞内表达与分泌表达。大肠杆菌胞内表达的重组蛋白常形成包涵体，因不正常的空间折叠结构而无活性并沉淀。分泌表达又可分为周质空间表达和胞外表达，而胞外分泌表达的重组蛋白因其氧化还原环境适宜于形成正常的蛋白空间结构，不形成包涵体，正常情况下为有活性可溶性蛋白，且分泌表达的蛋白很少受到蛋白酶降解。从而提高了活性蛋白的表达水平，降低分离成本。因此，胞外表达对于提高重组蛋白产量和纯度，简化下游工艺具有重要意义。

大肠杆菌常缺乏天然的胞外分泌机制，大多数外源蛋白无法分泌到培养基中。胞外渗漏表达是指采用理、化及遗传方法使宿主细胞壁或细胞外膜发生缺失或损伤，从而使目标蛋白渗漏到胞外培养基中。胞外渗漏表达采用的方法可分为：化学渗漏，即应用脂溶剂及其它化学试剂控制细胞渗漏；物理渗漏，即应用冻融等物理方法使细胞渗漏；生物渗漏，即应用抗生素等生物试剂使细胞膜或壁的合成受阻而导致渗漏；遗传渗漏，即使用遗传手段改变细胞壁或膜的通透性，使胞内蛋白部分选择性地渗漏至培养基中。遗传渗漏具有多种优势，如：可选择性的分泌目标蛋白，无需专门的渗漏工艺，无有毒化学试剂添加等。故遗传渗漏常为目标蛋白渗漏表达的首选。

目前报道的大肠杆菌胞外生产重组蛋白的方法常是通过理化诱变筛选遗传突变的胞外高产菌株。但该方法筛选过程复杂，机理不明，重复性差。理论上，遗传工程改造大肠杆菌可导致其细胞外膜或细胞壁缺陷，使其周质空间蛋白部分释放到培养基中。使用遗传工程突变的渗漏菌株进行胞外蛋白的生产鲜有报道。如：大肠杆菌的lpp突变体可以将周质空间蛋白渗漏至培养基中而不显著影响菌株的正常生长，但目标蛋白的渗漏比率及其产量仍然有很大的提高空间。此外，共表达裂解蛋白Kil或BRP（细菌素释放蛋白）也能改变大肠杆菌细胞外膜的通透性，从而使周质空间蛋白释放到培养基中。

发明内容

本发明提供一种大肠杆菌外源蛋白发酵和胞外分泌同时进行的重组蛋白胞外表达的用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，通过遗传工程改造方法得到的细胞壁或膜双基因敲除的通透性增强的分泌型菌株，并将胞内合成的外源蛋白通过信号肽或融合蛋白导入到细胞周质空间，进而选择性地渗漏至培养基中，提高蛋白表达水平并降低分离成本成为本发明的目的。

一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于：使用预先设计的细胞膜蛋白和细胞壁合成酶基因pal 和mrcB，或mrcB和lpp 的双敲除基因或其他基因组合的双敲除基因的引物进行PCR反应，得到两端为10～250 bp特定目标基因同源序列及中间为抗性标记序列的浓度为1～1000 ng/μl的pal 和mrcB，或mrcB和lpp 的双敲除基因或其它基因组合的双敲除基因的基因打靶片段，并分别通过电转化整合到宿主大肠杆菌染色体中，得到双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株；所述的其他基因组合指的是mrcA，mrdA，rodA，murC，rodZ中任意两个的组合。

所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述的双基因突变的分泌型大肠杆菌菌株含有的基因pal和基因mrcB编码区发生了突变，或者基因pal和基因mrcB的启动子区域发生了突变，从而使pal基因和基因mrcB无法表达出相应Pal和MrcB蛋白产物，或表达出降低了功能的Pal和MrcB蛋白产物，进而正常的细胞膜运输功能发生变化。

所述的一种用于重组蛋白分泌型表达的双基因突变大肠杆菌的构建方法，其特征在于：

所述的双基因突变大肠杆菌的应用包括：外源蛋白表达的分泌型重组大肠杆菌菌株构建、分泌型重组大肠杆菌的目标蛋白表达过程；