[发明专利]灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一组链阳菌素（streptogramin），灰绿霉素（griseoviridin）和绿灰霉素（viridogrisein）生物合成基因簇及其应用。 

背景技术：

链阳菌素类化合物是一类主要由链霉菌代谢合成的抗生素，与临床上常见的许多抗生素不同，这类型抗生素主要由两种结构上完全不同的化合物协同发挥功效，它们分别命名为类型A和类型B，其中A型抗生素是一类环状不饱和大环内酯而B型抗生素是一类六元或七元环脂肽。最早人们发现陆生灰绿链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427产生一组链阳菌素类化合物，它们分别是属于A类型的灰绿霉素，其结构式如图1所示和B类型的绿灰霉素，其结构式如图1所示，后者又叫做宜它霉素（etamycin）。单一的A型或B型抗生素仅具有一定程度的抑菌效果，但当二者联合应用后，能表现出明显的协同效应且具有广谱抗菌效果。它们的抗菌机制为：作用于细菌的50S核糖体亚基的不同位点，干扰细菌蛋白合成的延伸阶段，其中A类抗生素抑制氨酰tRNA与核糖体的结合，同时抑制肽键的形成；而B类抗生素加速肽酰tRNA的释放从而阻断了多肽链的进一步合成。当细菌翻译过程中，A类抗生素结合于核糖体大亚基后，会促进核糖体的构型变化增强B类抗生素的亲和力，因此AB两类化合物的协同作用活性能比单独作用提高100倍以上。链阳菌素类抗生素能够对抗一些极端抗药菌，越来越引起人们的重视。 

药物合成化学家已经开展了对链阳菌素类抗生素的化学合成和结构修饰工作，已经完成了灰绿霉素,维及霉素M₂（virginiamycin M₂）和马杜霉素Ⅱ（madumycin Ⅱ）这一类具有挑战性的聚酮-聚肽类大环内酯化合物的化学全合成研究，但收率较低。另外通过化学修饰原霉素ⅠA和原霉素ⅡA获得的奎奴普丁（quinupristin）和达福普汀（dalfopristin），已经开发成药物，二者协同应用能够有效的抑制一些万古霉素（vancomycin）抗性菌及其他一些革兰氏阳性菌，使得链阳菌素类抗生素的研究得到不断深入而成为新药开发的一大热点。 

生物合成和组合生物合成是上世纪末发展起来的重要的生物技术，近年来随着基因组学研究的快速进步，新的高通量基因测序技术的出现，λ-RED基因重组技术和高效异源表达技术的发展，组合生物合成技术获得迅速发展，给化学学科创造新化合物等方面带来新的契机。抗生素的生物合成基因通常位于染色体DNA或者巨型质粒上，主要由结构基因、调控基因和抗性基因组成，往往成簇排列，少有例外。组合生物合成是实现化合物结构多样化的重要途径，通过分析相关的生物合成基因簇，获得相应代谢途径信息，了解关键酶，底物和产物， 可以较为系统的获得相关化合物的代谢信息。再通过遗传操作进行基因阻断、置换或重组，有目的地对基因簇进行改造，从而利用生物技术手段生产“非天然”的天然化合物，为新药开发提供化学实体。获得的微生物突变株可以开发成优良的工程菌，为日后的工业化生产打下坚实的基础。利用不断发展的生物合成和组合生物技术，人们对越来越多的复杂抗生素进行了结构修饰和改造，获得了一系列新结构衍生物，有些生物活性优于或跟母体化合物相当。近年来随着微生物基因组测序、生物信息学分析及信息数据库的发展，大大缩短了抗生素生物合成和组合生物合成的研究周期及成本。 

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇。 

本发明的灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇来源于链霉素Streptomyces griseoviridis NRRL 2427，其特征在于该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第13530~118200位的碱基序列所示，包含36个基因，具体为： 

(1)负责灰绿霉素大环内酯骨架合成和后修饰的基因，即sgvE1、sgvE2、sgvE3、sgvE4、sgvE5、sgvE6、sgvQ和sgvP共8个基因： 

sgvE1位于基因簇核苷酸序列（SEQ ID NO.1，下同）第64158-77825个碱基处，长度为13668个碱基对，编码杂合的聚酮合酶与非核糖体肽合成酶，4555个氨基酸；