[发明专利]重组猪α干扰素及其在制备治疗猪巨嗜细胞病毒病的药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组猪α干扰素的一种新用途，具体的说是重组猪α干扰素及其在制备治疗猪巨嗜细胞病毒病的药物中的应用。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗增殖及免疫调节作用的分泌型糖蛋白，是机体防御系统的重要组成部分。依据干扰素对酸的敏感性通常分为I型干扰素(酸敏感型)和II型干扰素(耐酸型)两类，几乎所有脊椎动物均可产生这两类干扰素。I型干扰素主要起抗病毒和抗肿瘤作用，至今已发现INF-α、β、ω、κ、τ、δ以及干扰素样细胞因子limitin、IL28、IL29等；II型又称免疫干扰素，迄今为止仅发现INF-γ一种。由于干扰素具广谱、高效抗病毒功能，及其对免疫系统起关键调节作用，因此成为当今免疫学、遗传学和分子生物学研究最为活跃的领域之一。目前有5种猪干扰素I型干扰素α、β、ω、δ和II型干扰素γ被发现。猪INF-α、ω分别是由12个和5个以上的相关功能基因编码的蛋白质家族，这两种干扰素的各亚型之间同源性很高，天然INF-α常常是INF-α、ω功能基因表达产物的混合体，而INF-β、δ和INF-γ仅由单一基因编码。现在已完成基因克隆、测序和定位的猪干扰素基因主要包括INF-α、β、ω和INF-γ。

猪a干扰素(PolFN a)在兽医临床上可作为广谱抗病毒药用于猪病毒性疾病的防治。如对猪的流行性腹泻、轮状病毒腹泻、传染性胃肠炎等多种病毒性疾病有较好的防治作用，但目前国内用猪a干扰素治疗猪巨嗜细胞病毒感染的研究几乎空白，尚无相关报道。

本发明中的猪巨嗜细胞病毒病(porcine cytomegalovirus，PCMV)亦称细胞包涵体病毒。PCMV属于疱疹病毒科，β疱疹病毒亚科，巨嗜细胞病毒属的成员。PCMV分布相当广泛，该病至报道以来，在英国、日本、德国、美国和澳大利亚先后报道了该病的存在，其血清抗体阳性率达90％以上，全世界98％以上的猪受到过本病毒的感染，感染猪群98％以上的血清抗体均呈阳性。对3-5周龄仔猪的肺巨噬细胞高度敏感，感染后3-14天可看到巨嗜细胞形成和核包涵体，最高峰出现在接种后11-14天。感染猪后，感染细胞体积是正常细胞的6倍。患猪特征性临诊症状为食欲废绝，母猪繁殖障碍，表现为流产、死产、木乃伊胎、产弱仔等；仔猪有明显的眼炎、鼻炎和肺炎症状，生长发育不良，增重差，给猪场造成了严重的损失。

迄今尚未研制出有效的PCMV疫苗，在化学类治疗药物中，也尚未研制出特效药物来预防和治疗本病。

发明内容

本发明针对现有技术的不足提供一种重组猪α干扰素及其在制备治疗猪巨嗜细胞病毒病的药物中的应用。

提供一种重组后的毕赤酵母表达载体pGAPZα-IFNα的阅读框序列。

本发明所述的猪a干扰素具有序列表中序列1所示核苷酸序列。

一种重组猪α干扰素，通过以下方法制备：

A1：人工修饰后的猪a干扰素基因的合成：将天然IFNα核苷酸序列中的信号肽序列1-69位核苷酸去除，添加XhoI和XbaI酶切位点序列及保护碱基。将基因中第24位氨基酸的三联体密码子的第3个碱基进行点突变，即将TGC突变为TGT；第29位氨基酸的第2个碱基进行点突变，即将ACC突变为ATC；第48位氨基酸的第3个碱基进行点突变，即将TCC突变为TCT；第101位氨基酸的第1个碱基进行点突变，即将GAT突变为AAT；第132位氨基酸的第3个碱基进行点突变，将ACG突变为ACC；第158位氨基酸的第2位碱基进行点突变，由AAC突变为AGC；第161位氨基酸的第2位碱基进行点突变，由CTC突变为CCC；第167位氨基酸的第1个碱基进行点突变，由ATC变为GTC；第174位氨基酸的第1和第2个碱基进行点突变，由GTC突变为TCC；第179位氨基酸的第2个碱基进行点突变，由ACA突变为AGA，突变后的基因序列编码的氨基酸未改变猪天然IFNα的氨基酸序列，又为甲醇酵母所喜欢的密码子，在甲醇酵母中具有高表达效率；

A2：构建重组真核表达载体pGAPZα-IFNα：将克隆得到的IFNα基因，连接到PGM-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，得到PGM-T-IFNα；将PGM-T-IFNα和pGAPZα载体分别酶切后进行连接得pGAPZα-IFNα，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性菌株，质粒经双酶切后得到了与理论大小一致的载体片段和干扰素目的片段；