[发明专利]转基因高油酸油菜W-4 事件外源插入右边界旁侧序列及应用

说明书

  

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地说，涉及一种转基因高油酸油菜W-4外源基因整合事件的外源插入载体（fad2-ihpRNA）右边界旁侧序列及应用。 

背景技术

油酸普遍存在于植物油脂中，是一种18碳单不饱和脂肪酸，理化性质较多不饱和脂肪酸如亚油酸和亚麻酸稳定，耐高温不易被氧化，高油酸植物油是优质烹调用油，也是食品工业中普遍使用的氢化油的理想替代品。此外，油酸能降低人体血液中低密度脂蛋白胆固醇（LDL）水平，维持高密度脂蛋白胆固醇（HDL）含量；高油酸菜籽油不仅有益于人们的身体健康，而且耐储藏。发展高油酸油菜是目前油菜品质育种的一个重要组成部分。 

通过基因工程途径抑制油料作物种子中油酸脱饱和酶基因（fad2）表达是提高种子油中油酸含量的重要策略，在大豆、油菜等油料作物中广泛应用，转基因高油酸大豆、油菜国内外均有成功的报道。 

江苏省农业科学院经济作物研究所成功构建油菜种子特异性表达的fad2基因的ihpRNA表达载体，并通过农杆菌介导法转入甘蓝型油菜，获得油酸含量高达84%以上且遗传稳定的转基因高油酸油菜品系W-4。 

近年来，转基因玉米、大豆、棉花、油菜、水稻等作物已经在很多国家获准种植和商品化生产，一些转基因农作物被加工成食用油、食品或饲料。鉴于转基因农作物的生态安全或食用安全一直倍受争议，世界上多个国家和地区相继实施了转基因农产品标识制度，对转基因农作物产品进行严格的监督管理。 

转基因产品的检测主要依据转基因产品中外源基因的独特的序列信息、外源基因在植物表达载体上的组合方式、以及外源基因在受体基因组中的整合位点信息，而建立起来的各种方法。而不同的方法各有利弊。 

1．基因特异性检测方法 

一个特定的基因具有特定的序列特征，即特异性，以此特征建立的检测方法对于检测特定基因的存在与否是十分有效的；但是，问题是大量的转基因载体使用了相同的基因，因此，基因特异性检测无法区别不同来源的转了相同基因的转基因产品。

2．载体特异性检测方法 

不同的植物表达载体其T-DNA内部基因元件之间的组成或排列具有一定的特征。可以依据这些特征鉴别使用了类似基因元件的不同植物表达载体。但是同一个表达载体可能获得一个以上的转化植株，甚至可能被转化到不同的物种中，而这些转化株未必全部通过了转基因的安全评估。因此，载体特异性检测方法不能识别不同的转基因品系，因而，也无法判别该转基因品种（系）是否通过了转基因安全评估。

3．事件特异性的检测方法 

鉴于独立的转基因事件中，外源基因在受体基因组中的整合位点具有随机性，即使相同的载体多次转化，整合的位置也是不可重复的。因此，外源基因的整合位点具有高度的特异性。可以利用整合位点的序列特征，开发出转基因事件特异性的检测方法，应用于转基因产品的定性定量分析。

分离外源基因插入位点的旁侧序列是建立事件特异性检测方法的基础。由于外源基因在整合过程中，T-DNA和基因组之间可能发生重组，导致T-DNA边界的部分缺失。增加了分离插入位点旁侧序列的难度。2000年2月，欧盟特别资助了Qpcrgmofood European Project项目，该项目已经成功分离得到多个品种旁侧序列并应用于建立转基因事件的特异性检测。国内中国农业科学院油料作物研究所卢长明研究员实验室也相继获得了多种转基因油菜的旁侧，并建立了相应的事件特异性检测方法。 

经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现关于甘蓝型转基因高油酸油菜W-4事件外源基因插入载体（fad2-ihpRNA）右边界旁侧序列和基于此特征序列建立的事件特异性PCR检测的报道。 

发明内容

技术问题  本发明目的提供一种转基因高油酸油菜W-4事件外源插入载体旁侧序列及其应用。 

技术方案 

本发明是这样实现的：

本发明以甘蓝型转基因高油酸油菜品系W-4为材料，利用TAIL-PCR技术经过4轮PCR扩增获得W-4事件外源插入载体右边界旁侧序列SEQ NO.10，序列总长度 785碱基，其特征是，第1-495碱基来源于外源插入载体T-DNA右边界，第496-785碱基来源于与T-DNA右边界相连的油菜基因组序列。该油菜基因组序列碱基组成特征：G+C 含量为 31.27%，A+T 含量为68.73%。

利用所述的序列设计检测转基因高油酸油菜外源基因整合事件W-4的事件的特异性PCR引物。 

所述的特异性PCR检测引物，其特征是：