[发明专利]一种β-葡糖苷酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属于酶基因和酶工程技术领域，具体涉及一种β-葡糖苷酶及其应用。

背景技术

β-葡糖苷酶（EC 3.2.1.21）的英文名称是β-glucosidase，又称β-D-葡糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。属于外切水解酶类，是一类在亲核分子间催化转移糖苷的酶，可以在短链的寡糖或纤维二糖内部、在带有芳香基团或烷基的碳水化合物的残基之间打断β-1，4-糖苷键。β-葡糖苷酶是纤维素酶系中的一种，是纤维素降解的限速酶，在纤维素酶水解过程中将各种寡糖及纤维二糖降解为葡萄糖，是最后的关键酶，对纤维素糖化水解具有关键性作用。β-葡糖苷酶还具有转糖苷作用，在一定的条件下可以通过转糖苷作用将两个葡萄糖分子合成一个槐糖分子。已发现槐糖是纤维素酶基因表达的强诱导物。一般认为丝状真菌中纤维素酶合成的诱导机制是：存在于分生孢子和菌丝表面的少量组成性纤维素酶，首先降解纤维素生成纤维二糖等寡糖，然后在质膜结合的葡萄糖苷酶的专苷作用下，生成槐糖等诱导物，经细胞膜上的组成性透性酶系进入细胞内，启动纤维素酶的合成。利用β-葡糖苷酶催化合成槐糖来诱导纤维素酶的生产具有巨大的商业价值和现实意义。

β-葡糖苷酶广泛存在于植物、动物和微生物。在微生物中，曲霉被普遍认为是产生β-葡糖苷酶的优良菌种，其中尤以黑曲霉和木霉的产量最高。但目前β-葡糖苷酶液态发酵酶活普遍偏低；而通过固态发酵生产β-葡糖苷酶又会使成分复杂，不宜提取。故采用基因工程技术构建高产β-葡糖苷酶的工程菌株，具有重要的现实意义。

纸状葡萄穗霉具有嗜纤维性，已报道的其所产纤维素酶具有较宽的pH适应性，并且对于碱性条件也有较好的耐受性。因此，从纸状葡萄穗霉中克隆新型的β-葡糖苷酶基因，除可以研究其酶学特性以外，还可为研究糖苷水解酶家族特征及酶的体外定向改造提供理论上的指导。

发明内容

本发明的目的是提供一种β-葡糖苷酶及其应用，即一种具有工业应用价值的新型β-葡糖苷酶，从而弥补现有技术的不足。

本发明获得的β-葡糖苷酶的基因，包含有2508bp的DNA，编码一个由817个氨基酸组成的蛋白质。

本发明的β-葡糖苷酶，包括有：

a）序列为SEQ ID NO：1的酶；

b）在a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。

编码上述β-葡糖苷酶的核苷酸，其序列为SEQ ID NO：2。

本发明还提供用于表达上述β-葡糖苷酶的重组表达质粒，是将序列为SEQ ID NO：2的核苷酸片段插入到原核表达载体中构建的。

所述的原核表达载体为pGm。

本发明还涉及携带有表达上述木糖苷酶的重组表达质粒的重组菌。

本发明的β-葡糖苷酶用于燃料乙醇等能源物质的生产、食品工业中的风味酶、饲料的生产等。

本发明提供的β-葡萄糖苷酶，发酵进行到第5天时，发酵液酶量达到最大值5313.82U/ml；其最适温度为50℃，最适pH为5.8。并且该酶还具有很高的木糖苷酶活性，为58.20U/ml。另外，本发明的β-葡萄糖苷酶还具有脱氧葡萄糖和潮霉素抗性以及转糖苷作用。在转糖苷作用下，可以使纤维二糖等寡糖生成槐糖等诱导物，再经细胞膜上的组成性透性酶系统进入细胞内，启动细胞内纤维素酶的合成。故而可以利用β-葡萄糖苷酶催化合成槐糖来诱导纤维素酶的生产，更具有巨大的商业价值。

附图说明

图1：本发明的β-葡糖苷酶基因DNA电泳图谱；

图2：本发明的质粒pGm-g10158的构建图；

图3：本发明的葡糖苷酶在不同温度下的相对活力；

图4：本发明的葡糖苷酶在不同pH值下的相对活力；

图5：本发明的葡糖苷酶在不同温度下的热稳定性。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一、β-葡糖苷酶的筛选及检测

1、纸状葡萄穗霉菌(购自中国微生物菌种保管委员会普通微生物中,CGMCC 3.5365)总DNA提取

（1）将纸状葡萄穗霉菌用CMC液体培养基，在30℃、200rpm条件下摇床培养48小时；