[发明专利]以纤维素为碳源发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地本发明涉及以纤维素为碳源发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯的方法。

背景技术：

聚羟基脂肪酸酯（PHA，polyhydroxyalkanoates），是近20多年迅速发展的生物高分子材料，是微生物合成的一种细胞内聚酯。具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的热加工性能，可作为生物医用材料和生物可降解包装材料。PHA还具有非线性光学性、压电性、气体相隔性等高附加值性能。研究发现，PHA可以作为生物燃料的原料，是一种比较理想的石油替代品。PHA可分为短链PHA和中长链PHA。短链PHA（PHA_SCL），含C4-C5单体，以PHB（聚三羟基丁酸酯，Poly-3-hydroxybutyrate）为代表，硬度高可塑性低。含6-14个碳原子的中等链长的PHA（PHA_MCL）是结晶度很低的弹性体，在药物释放及组织工程等方面具有很广阔的应用前景。

目前聚羟基脂肪酸酯的生产主要是以发酵法为主，但普遍存在成本高或产率低的问题。利用工业废水和城市废水中丰富的有机物做碳源生产PHA可降低原料费用，但是产率太低。以葡萄糖为原料制备PHB，原料成本较高，工业生产仍受限制，目前，市场上PHB价格大约为20美元/千克，为普通石化塑料的10倍，因此，PHB还无法与石化塑料相竞争。

假单胞菌在各种研究过的微生物中合成PHA_MCL能力最强，可以利用多种相关碳源和非相关碳源大量合成和积累的PHA，常用的底物有丙烯酸、葵酸及相应的盐、葡萄糖、淀粉、生活污水等。目前认为细菌PHA合成酶分为3类，第1类以R.eutropha为代表的PHA_MCL合成酶phaC；第2类以P.oleovorpha和P.aeruginosa为代表的PHA_MCL的合成酶phaC1和phaC2；第3类以Chromatium vinosum和Tiio-capsia vioiacae为代表的PHA合成酶phaC和phaE。以门多萨假单胞菌合成酶基因phaC1，利用大肠杆菌表达载体构建基因工程菌，以添加辛酸的LB培养基发酵，制备中长链聚羟基脂肪酸酯，产物由3-羟基己酸和3-羟基辛酸两种单体组成，但是产量还较低。将phaC1基因构建到大肠杆菌JMU193染色体上，获得高产稳定表达菌株；对宿主细胞进一步改造，双敲除fadR和fadB/fadA，得到PHA_MCL含量可达细胞干重的30%；近期研究表明，在大肠杆菌中共表达paaG、paaF和ydbU，可提高产物量至0.37 g/L、0.25 g/L、0.33 g/L，带有fadB基因的WB101菌株，以癸酸钠为碳源，表达外源phaC2基因，可得到两倍量PHA_MCL。

纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，是植物细胞壁的主要成分，是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50%以上。纤维素作为一种廉价碳源，是世界上最丰富的可再生自然资源，我国每年仅作物秸秆的纤维产量就可达2亿吨以上。已有利用纤维素制备生物乙醇、丁醇等生物燃料的应用。目前还未见以纤维素为碳源发酵制备中长链聚羟基脂肪酸酯的报道。

当脂肪酸碳链长度为12-18C时，其甲酯就是生物柴油的基本成分。中长链羟基脂肪酸甲酯（3HAME）是一种新型的生物燃料，对其研究和开发刚刚开始，有人利用酸催化的水解方法，把PHB和MCL PHA分别转化为3-羟基丁酸甲酯（3HBM）和中长链羟基脂肪酸甲酯（MCL HAM），燃烧热值分别为19.43KJ/kg、36.5KJ/kg（罗容聪，汕头大学硕士论文,2008）。但是利用水解酶和氢氧化钾催化醇解的研究还未见报道。

发明内容：

针对目前PHA_MCL发酵制备成本高、收率低的问题，本发明提供一种以廉价纤维素为碳源发酵生产中长链聚羟基脂肪酸酯的方法。

本发明的另一个目的是提供利用中长链聚羟基脂肪酸酯制备生物燃料中长链羟基脂肪酸甲酯（3HAME）的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术解决方案如下：

1、中长链聚羟基脂肪酸酯PHA_MCL发酵制备：

（1）    构建包含聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phaC1的重组工程菌；phaC1基因来源于油田土壤分离出的铜绿假单胞菌，重组工程菌为大肠杆菌重组工程菌。