[发明专利]一种酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酵母葡聚糖含量的检测方法，具体涉及一种酵母葡聚糖中具有生物活性的非水溶性葡聚糖含量的检测方法。

背景技术

酵母细胞中除含有大量的蛋白质外，还含有甘露聚糖、甘露糖蛋白、β-1,3-葡聚糖、其他杂多糖和几丁质等成分。目前已被应用的酵母多糖产品主要有甘露糖系列的甘露聚糖、甘露寡糖、甘露糖蛋白，含多种多糖成分的酵母葡聚糖，非水溶性的酵母细胞壁β-1,3-D-葡聚糖等。

目前，对于酵母葡聚糖含量的检测方法有很多，都是对于酵母葡聚糖中水溶性葡聚糖含量的检测方法，如利用多糖的还原性测定还原性多糖的方法有3，5一二硝基水杨酸盐比色法；利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，然后再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色的物质的这一性质进行测定，这类方法有地衣酚-硫酸法、苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，其中非水溶性多糖很难彻底水解，若高温水解则会破坏目的组分，无法用于产品质量的检验、监督，使得酵母非水溶活性多糖产品的质量控制、生产过程中非水溶活性多糖的检测产生了很大的不确定性。国外常用酶法检测法检测非水溶性葡聚糖的含量，利用专一性酶对多糖底物的催化反应确认是否含有非水溶性葡聚糖，再结合其他方法测定非水溶性葡聚糖含量，但是此方法条件苛刻，对设备要求高，不适合一般实验室操作。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种酵母葡聚糖中具有生物活性的非水溶性葡聚糖含量的检测方法，采用特殊工艺除去单糖、低聚糖、水溶性杂多糖以及蛋白的干扰，采用合理的酸降解、水解，能够将非水溶性葡聚糖完全转化为水溶性葡聚糖，有效地解决了非水溶性葡聚糖难以降解或降解不完全的缺陷，减少了降解时间，降低了水解温度，为酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的定量检测提供了依据。 

一种酵母葡聚糖中非水溶性葡聚糖含量的检测方法，主要步骤包括：顺次经过除去碱溶性成分、除去酸溶性成分、浓酸降解、稀酸水解，将非水溶性葡聚糖完全转化为水溶性葡聚糖，用苯酚-硫酸法测定非水溶性葡聚糖的含量，并对检测方法进行精密度和回收率研究，具体步骤包括：

（1）除去碱溶性成分

取烘干粉碎的待测多糖样品，分别称取20-200mg于3-5个离心杯中，分别加入碱溶液，充分震荡5-10min，离心5-20min，弃去上清液，如此重复2次；

（2）去除酸溶性成分

向步骤（1）中弃去上清液的3-5个离心杯中，分别加入酸溶液，充分震荡5-10min，离心5-20min，弃去上清液，如此重复2次；

（3）浓酸降解

将步骤（2）中弃去上清液的3-5个离心杯中的沉淀分别转移到相应的100mL碘量瓶中，分别向各个碘量瓶加入酸溶液，充分震荡2-5min，室温放置20-30min；

（4）稀酸水解

向经步骤（3）酸处理后的3-5个碘量瓶中分别加入40mL-80mL水，接上冷凝管，100℃水解2-6小时，取出，冷水浴中降温到室温，分别转移到100mL容量瓶中，并定容得待测样品溶液；

（5）苯酚-硫酸法测定非水溶葡聚糖含量

配制50g/L的苯酚溶液：称取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀释至100mL，混匀，置冰箱中保存，备用；

配制葡聚糖标准储备溶液：精密称取分子量10000、干燥至恒重的葡聚糖标准品P82 0.5000g，加水溶解，并定容至50mL，混匀，置冰箱中保存；

配制葡聚糖标准溶液：吸取葡聚糖标准储备液1.00mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存；

标准曲线绘制：精密吸取葡聚糖标准溶液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL分别置于25mL比色管中，准确补充水至2.0mL，加入50g/L的苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸10min，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡聚糖的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，得出标准曲线的回归方程为：y=4.405x-0.0031，R²=0.9997

式中y为葡聚糖的质量浓度，单位为mg/mL，x为吸光度值，R为线性相关系数；