[发明专利]一种暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法，属于低温生物学技术领域。

背景技术：

暗色唇鱼Semilabeo obscurus Lin，隶属于鲤科（Cyprinidae）野鲮亚科（Labeoninae）唇鱼属（Semilabeo）。由于该鱼体肥、肉嫩、味美，成了捕捞的首选目标。又因其具有群居岩洞的生活习性，便成为不法分子电、毒、炸的最大受害者，随着鱼类资源的利用强度加大和捕捞技术的更新，鱼类生物多样性呈下降趋势，暗色唇鱼已成为李仙江流域珍稀濒危物种。且暗色唇鱼1989年被列入云南省II级保护动物，1998年被列入《中国濒危动物红皮书》。为了保护、开发利用这一珍稀的土著鱼类资源，2007年由云南省环保局批准立项，云南大唐国际李仙江流域水电开发有限公司委托中国科学院昆明动物研究所开展了暗色唇鱼的人工增殖放流研究。而开展暗色唇鱼的精子冷冻保存研究，建立精子库，长期保存精子，是种质资源保护与保存的有效途径之一，也能为遗传育种提供优良种质材料。

自从1949年首次用甘油作为抗冻剂冷冻成功保存精子以来，精子低温冷冻保存的研究取得了很大进展，并逐渐发展成为物种迁地保护和遗传种质资源保存的一个重要手段。在鱼类塘养种群遗传管理实践中，精子低温和超低温冷冻保存能有效地“延长”繁殖个体的繁殖寿命，并在塘养种群的世代数最小化方面显示出很广泛的应用潜力，但该技术仅在一小部分动物物种中使用。

经文献检索，未见与本发明的相同报道。

发明内容：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种方法简单、操作性强的暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法。

本发明的暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法，其具体步骤如下：

a.配子的采集：采精方法为轻压腹部法，选择形态正常、生长良好、无疾病、达到性成熟的亲鱼原种或良种，用100 ppm的MS-222麻醉5 min，鱼类腹部用毛巾擦干，然后轻轻挤压腹部，成熟的精液自然流出到5 mL离心管中；

b.鲜精活力检测：先用移液器滴一滴水于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅拌，观察其活力，鲜精活力在85%以上的精液样品用于精子冷冻；

c.冷冻方法：将精液与抗冻液按常规三步稀释法稀释至精子终密度为2.5×10⁸个/mL后分装入1.8 mL冻存管中，经4℃平衡30 min，然后在液氮面上方6 cm处平衡10 min，液氮面上平衡5 min后投入液氮中保存；其中：抗冻液为稀释液D-15+5%甲醇。

使用时将保存的精子在40℃水浴中解冻，然后按照常规方法进行人工授精。

本发明的各步骤中所用的百分比为体积百分比。

本发明具有成本低，操作简便，保存时间长，复苏后精子的活力较高，人工繁殖的暗色唇鱼的受精率和孵化率较高，能投入规模生产的优点；对于开展鱼类资源恢复与重建也具有重要意义。

具体实施方式：

本发明的暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法，其具体步骤如下：

1、配子的采集：采精方法为轻压腹部法，选择性成熟的优良亲鱼，用100 ppm的MS-222 (Tricaine，C₁₀H₁₅NO₃S)麻醉5 min，鱼类腹部用毛巾擦干，然后轻轻挤压腹部，成熟的精液自然流出到5 mL离心管中；

2、鲜精活力检测：先用移液器滴一滴水于载玻片上，对准视野，然后用针尖挑取上述精液立即于显微镜下搅拌，观察其活力，鲜精活力在85%以上的精液样品用于精子冷冻；

3、冷冻方法：将精液与抗冻液按三步稀释法稀释至精子终密度为2.5×10⁸个/mL后分装入1.8 mL冻存管中，经4℃平衡30 min，然后在液氮面上方6 cm处平衡10 min，液氮面上平衡5 min后投入液氮中保存；抗冻液是以稀释液D-15（0.8% NaCl、0.05% KCl、1.5% Glucose）为基础液，其中加入5%甲醇。

4、鲜精寿命检测：即精子从被激活至视野中90%以上的精子基本不动为止所持续的时间；

5、细胞膜完整率检测：精液稀释100倍后，用0.4%台盼蓝染色3 min；细胞膜破损的精子头部被染成蓝色，而细胞膜完整的精子头部不被染色；显微镜下计算未染色的精子数占总精子数的百分比；