[发明专利]猪基因组假attP位点及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和生物医学工程领域，具体涉及猪基因组的假attP位点及其应用。

背景技术

运用各种分子手段将外源基因整合于猪基因组，赋予猪特定的性状，是推动猪用于基础科学、农业和医学研究的有效途径。从位点特异性的角度考查，外源基因的整合手段可分为非定点和定点两类。非定点型包括裸DNA显微注射、病毒介导、转座子等。虽然病毒介导和转座子在基因转移效率上有较大提高，但是由于识别位点的严谨性较低，整合特异性没有实质性改进，因此难以对整合位点进行严格控制，外源基因的表达也难以预期(马元武等.转座子SleepingBeauty和PiggyBac.中国生物化学与分子生物学报,2010,26(9):783-787)。为了克服上述不足，各种定点型技术应运而生。基因打靶是最为准确的整合策略，但其依赖于同源重组，而自然条件下重组频率很低；此外，猪胚胎干细胞(ES)与诱导多能干细胞(iPS)技术目前尚未成熟,因此通过基因打靶实现外源基因的定点整合难度非常大(闫益波等.猪诱导性多能干细胞技术的研究进展及应用前景.遗传,2011,33(4):307-313.)。研究人员随即转向位点特异重组技术(SSR,site-speccific recombination),其中应用最为广泛的是Cre/LoxP、FLP/FRT系统。二者隶属于位点特异重组酶的酪氨酸家族，作用机理相似，均介导可逆重组反应，这就决定了二者介导外源基因定点整合的净效能仍然较低；而且实际使用中还需将其识别序列“预置”于基因组的特定位点，从可操作性的角度来讲难度反而增大(Nern A,et al.Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes.Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(34):14198-14203.)。ZFN(锌指核酸酶)和TALEN(转录激活样因子核酸酶)对识别模块(DNA结构域)和功能模块(FokI核酸酶)进行了巧妙结合，可借助细胞内的双链断裂(double-strand break,DSB)和非同源末端连接(non-homologous endjoining,NHEJ)介导外源基因的定点整合，但实际中要设计和筛选高特异性和高亲和性的核酸酶并不容易(Gabriel R,et al.An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity.Nat Biotechnol,2011，29(9):816-823.)。现实的困境促使研究人员开始探询外源基因在猪基因组内高效定点整合的新策略。