[发明专利]检测纤维二糖酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测生物酶活性的方法，尤其涉及一种检测纤维二糖酶活性的方法。

背景技术

纤维素酶是一种多组分的复合酶，它包括内切型葡聚糖酶（EC3.2.1.4，也称C_X酶、CMC酶）、外切型葡聚糖酶（EC3.2.1.91，也称C₁、微晶纤维酶）和纤维二糖酶（EC3.2.1.21，也称β-葡萄糖苷酶）等三种主要组分。普遍认为在将天然纤维素降解成葡萄糖的过程中，必须依靠这三种组分的协同作用才能完成。纤维素大分子首先在C₁酶和C_X酶的作用下逐步降解成纤维二糖，而纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水解成葡萄糖。

目前应用最广、研究最为深入的纤维素酶生产菌种是里氏木霉（Trichoderma reesei）的优良突变株。在该菌种的纤维素酶制剂中，内切型及外切型-β-葡聚糖酶活力较高，但不足之处是纤维二糖酶产量很低。在利用纤维素酶制剂水解纤维素的过程中，常常由于纤维二糖酶的活力很低造成纤维二糖的累积，而纤维二糖又会对纤维素酶的催化作用形成强烈的反馈抑制。

在纤维素酶解过程中提高纤维二糖酶的活力意味着提高纤维素水解效率和葡萄糖产量。因此，采用纯化的纤维二糖酶、固定化酶技术等多种方法被广泛用于增强反应体系中纤维二糖酶的活力，而纤维二糖酶的活性成为衡量这些方法优越性的重要指标。

目前，对于纤维二糖酶活性的测定普遍采用的方法中，Barush和Swiain法是以水杨苷为酶反应底物，检测水解后产生的极微量的葡萄糖，反应易受干扰，且检测灵敏度不高；荧光法灵敏度高且快速，但是由于实验过程操作复杂，且重现性不好，现在应用不多；比色法是以对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（pNPG）为酶底物，检测底物水解后释放出来的对硝基苯酚，而对硝基苯酚是一种很难被生物降解的、危害环境的高毒性有机物。因此，研究一种灵敏度及精确度高且对环境无害的纤维二糖酶活性检测方法是亟待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种更加快速、灵敏、精确、且具有对环境无害、成本低廉的检测纤维二糖酶活性的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种检测纤维二糖酶活性的方法，其步骤包括：将一种可用于检测纤维二糖酶活性的纳米金探针溶液按照20∶1的体积比加入到待测溶液中，其中每20体积的纳米金探针溶液中含有2～4体积的纳米金探针浓缩液（所述浓缩液为纳米金探针制备时高速离心后的含纳米金探针沉淀的浓缩液），将检测温度控制在30℃～35℃，检测pH值控制在4.0～4.5，待纳米金探针反应完全后（一般至少反应10min），根据检测后溶液体系中纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度变化，即可判断待测溶液中是否含有纤维二糖酶（定性检测）（例如，紫外可见分光光度计测定时，当620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值大于0.2631时则可认为含有纤维二糖酶）；所述纳米金探针包括纳米金颗粒，所述纳米金颗粒上修饰有纤维二糖和6-巯基己-1-醇。

上述的检测方法中，所述纤维二糖酶活性与纳米金探针表面等离子体共振吸收峰强度呈线性关系，所述线性回归方程为A=0.3642n+0.6273，其中A优选为紫外可见光吸收图谱中620nm处的吸光度与520nm处的吸光度比值（A620/A520），根据检测得到的吸光度比值A即可得到酶活相关值n，再根据表达式C=1.5×10ⁿ即可定量测得待测溶液中的纤维二糖酶酶活C，C的量纲为U/mL（定量检测）。在定量检测中，所述纤维二糖酶酶活C的检测范围优选为0.15 U/mL～150 U/mL。

上述的检测方法中，所述纳米金探针的粒径优选为30 nm～80 nm。

上述的检测方法中，所述纳米金探针的Zeta电位优选为-30 mV～-40 mV。