[发明专利]一种基于质谱技术快速鉴定布鲁氏菌的方法及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种布鲁氏菌核酸指纹图谱制备的方法，以及使用该方法，对布鲁氏菌进行快速鉴定的方法。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)又称地中海弛张热，马尔他热，波浪热或波状热，是由布鲁氏菌引起的人畜共患性全身传染病，主要通过皮肤、黏膜、消化道和呼吸道感染，尤其以感染羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌最为严重。猪种布鲁氏菌感染人较少见，犬种布鲁氏菌感染人罕见，绵羊附睾种布鲁氏菌、沙林鼠种布鲁氏菌基本不感染人。其临床特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大等。1886年英国军医Bruce在马尔他岛从死于“马尔他热”的士兵脾脏中分离出“布鲁氏菌”，首次明确了该病的病原体。1897年Wright与其同事发现病人血清与布鲁氏菌的培养物可发生凝集反应，称为Wright凝集反应，从而建立了迄今仍用的血清学诊断方法。我国古代医籍中对本病虽有描述，但直到1905年Boone于重庆对本病作正式报道。目前该病在世界分布，只有几个国家消灭此病，而在中国的东北，华北，西北一带有流行和分布，其它地区有散发，且日益广泛和危害严重。对畜牧业和人类来严重经济损失。 

布鲁氏菌是一类革兰阴性的短小杆菌，两端钝圆，偶见两极浓染，一般长0.4-1.5um，宽0.4~0.8um，羊种布鲁氏菌较小，长 0.3~0.6um，近似球状，猪种布鲁氏菌和牛种布鲁氏菌呈杆状。通常呈散在状态．很少成对或短链状排列。该菌无鞭毛，无芽孢．光滑型有荚膜。常在细胞内寄生。内毒素是重要的致病物质。布鲁氏菌有强侵袭力，细菌可通过完整皮肤和粘膜进入宿主。布鲁氏菌有6个生物型，我国流行的是羊布鲁氏菌，牛布鲁氏菌和猪布鲁氏菌三种，其中以羊布鲁氏菌最常见。自然情况下，有60多种动物可感染布鲁氏菌，其主要是山羊，绵羊，牛和猪，以流产为主，孕期动物最为宜感。人类对布鲁氏菌易感，细菌进入人体后，迁延不愈，反复发作，发热呈波浪式，如不治疗，后果严重。 

布鲁氏菌是需氧菌．营养要求较高，需硫胺素．烟酸胺和酵母生长素。葡萄糖．甘油和复合氨基酸可促进布鲁氏菌的生长：泛酸钙和赤鲜醇也可促进某些布鲁氏菌的生长；来自人或动物的标本最好接种在胰酶消化液或血液培养基中。在固体培养基上，菌落为无色．半透明．圆形．表面光滑．边缘整齐．中央稍凸起．直径约2~3mm。有时可出现黏液样或干燥的硬皮样菌落；在血琼脂平板上，表现不溶血。在液体培养基中，呈均匀混浊生长，不形成菌膜；在柯氏染色法(沙黄与孔雀绿对染)培养基上，该菌为鲜红色，其它杂菌被染成绿色。该菌对磺胺及链霉京．四环素、庆大霉索等均较敏感，面对青霉素及头孢菌素则不敏感。根据临床症状、流行病学特点以及布鲁斯菌以上生化特性，不难做出布鲁氏菌病的初步诊断，但由于在临床上小肠结肠炎耶氏菌、乙型副伤寒杆菌、大肠杆菌O:157感染存在相似的症状，必须借助实验室诊断技术才能对布鲁氏菌病进行最后确诊。为了建立适合本病诊断和流行病学调查的快速、敏感、特异、准确的方法，国内外许多学者进行了大量研究，并取得了显著的成绩。先后建立了病原鉴定、荧光抗体中和检等检测方法。我国目前应用虎红和试管凝集的方法，它们的敏感性及特异性差，是国际贸易淘汰的技术，且反应时间较长，与我国实际检测普查工作需求存在一定的矛盾。

目前布鲁氏菌病的诊断主要依靠针对脂多糖的血清学试验，特异性不强，常常出现假阳性结果。而且，由于布病感染后2周血中才开始出现抗体，所以感染早期血清学诊断往往出现假阴性的结果。以PCR为基础的核酸检测方法，对布病的早期诊断和传染源的发现有重要意义。单重PCR检测，当引物针对的序列发生了突变时则可能出现假阴性结果。而针对同种病原的多重PCR检测，因为针对的是多个基因，虽假阴性率降低，但操作比较复杂。

近年来，已经出现质谱技术来检测核酸和蛋白质领域，其中质谱技术应用于核酸检测领域的理论基础在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，如ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP的分子量依次为271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da（其中ddTMP是经过修饰的），它们之间的最小分子量差异在16Da，完全可以通过质谱进行分辨。使用质谱能够对碱基突变或多态位点（SNP）、插入/缺失（InDel）、甲基化位点、基因定量、拷贝数变化（copy number variation，CNV）等多种DNA变化类型进行检测。