[发明专利]一种拟穴青蟹基于微卫星标记的系谱认证方法

说明书

技术领域

本发明属于拟穴青蟹养殖分子标记辅助育种领域，特别涉及一种拟穴青蟹基于微卫星标记的系谱认证方法。

背景技术

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Scylla)，在我国主要分布于长江口及以南沿海海域，是我国重要的海洋渔业资源和海水养殖蟹类。拟穴青蟹具有体型大、生长快、肉味鲜美等优点，颇受广大消费者青睐。近年来，我国拟穴青蟹的人工养殖年产量一直稳定在10万吨以上，保持了健康的发展势头。

在拟穴青蟹家系选择育种中，需要将培育的多个家系混合在一个池塘中进行养殖，以保持养殖环境等因素的一致性，并对不同家系的生长、抗逆性能进行评价，从而选择表现优秀的家系进行育种。育种学家常采用物理标记，如：注射荧光粉的方法对混养的家系进行区分。由于拟穴青蟹等甲壳类动物营蜕壳生长方式，因此，随着蜕壳次数的增加，物理标记将随之减弱或消失。采用分子标记的方法进行辅助育种，能够起到很好的效果。微卫星标记是一种共显性分子标记，已经在动物新品种选育中得到了应用。目前，尚未见微卫星分子标记在拟穴青蟹选择育种中应用的研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种拟穴青蟹基于微卫星标记的系谱认证方法，该方法能够克服物理标记的不足，可准确、有效区分拟穴青蟹不同家系来源的个体，适用于家系选育中鉴定混合养殖的多家系来源的不同个体，将促进拟穴青蟹人工选育工作健康、快速发展，具有良好的应用前景。

本发明的一种拟穴青蟹基于微卫星标记的系谱认证方法，包括：

（1）取拟穴青蟹肌肉组织100-150mg，置于500~600μl组织提取液中剪碎，加入终浓度为20~25mg/ml的蛋白酶K和终浓度为100~110μg/ml的RNase A，55~60℃下消化2-3个小时；用混合液抽提，然后用组织提取液2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，再经乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于50~60μl TE缓冲液中；最后将DNA浓度稀释为100~110ng/μl，并保存在-20℃备用；

（2）采用微卫星引物对上述得到的待检测个体的DNA进行PCR扩增；

（3）采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，对PCR扩增产物进行染色和显色，根据扩增产物的不同迁移距离确定拟穴青蟹个体的基因型；

（4）利用软件对上述拟穴青蟹基因型进行分析得到聚类图谱，用以区分拟穴青蟹个体。

所述步骤（1）中的组织提取液的组分为10mmol/L Tris-Cl,pH8.0；100mmol/L EDTA,pH8.0；100mmol/L NaCl；0.5wt%SDS。

所述步骤（1）中的混合液为体积比25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇。

所述步骤（1）中的TE缓冲液的组分为10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；10mmol/L EDTA，pH8.0。

所述步骤（2）中的微卫星引物共7对，如表1所示：

表1本发明所用的7对微卫星引物的序列、退火温度及GenBank登陆号

其中，F指上游引物，R指下游引物。

所述步骤（2）中的PCR扩增条件为：

PCR反应体系包括：基因组DNA模板1μl、终浓度均为0.4μmol/L的上下游引物、终浓度为1.5mmol/L Mg²⁺、终浓度为0.2mmol/L dNTP、0.75U Tag DNA聚合酶和1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，特异性退火温度退火50秒，72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟。

所述步骤（3）中的变性聚丙烯酰胺凝胶质量百分比浓度为6%。

所述步骤（4）中的利用软件对拟穴青蟹基因型进行分析具体为：将拟穴青蟹基因型数据转换为生物学软件NTsys2.1所识别的格式，根据使用说明书的提示，计算得到两两个体间的遗传距离；再将距离矩阵输入软件MEGA4.0，采用UPGMA法进行聚类分析，即得聚类图谱。

有益效果