[发明专利]一种启动子及其应用

权利要求书

1.一种启动子，其特征在于：其具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

2.扩增权利要求1所述启动子的引物对，其特征在于：两条引物的序列分别如序列表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

3.权利要求1所述启动子的应用，其特征在于：所述应用是在盐胁迫诱导下驱动目的基因表达；所述目的基因是GUS基因。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

A、启动子的克隆

根据启动子的序列SEQ ID NO：2设计引物对，根据载体pCAMBIA3301的多克隆位点，引物末端分别引入EcoRI和BglII酶切识别位点，以CTAB法提取的大豆测序品种Williams82的DNA为模板，PCR扩增启动子；

引物序列为：

5'-CGGAATTC GATCTACTTAAGTCAATAAC-3'；

5'-GAAGATCT CGTGGCGCTTCTTTTTTTTA-3'；

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1113bb左右的条带；连T载体，挑阳性克隆，测序；

B、重组表达载体的构建

①提取含有正确测序的Promoter序列的T载体质粒，用限制性内切酶EcoRI和BglII酶切，回收酶切产物；

②用限制性内切酶EcoRI和BglII酶切空载体pCAMBIA3301，回收载体骨架；

③用T4连接酶将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接；

④将步骤3的连接产物热激转化感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pCAMBIA3301-P::GUS；

C、农杆菌的转化

采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作如下：

a.取出冻存的200μl感受态细胞，融化后加入5-10μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min；

b.放入液氮中5min后取出，将管转入37℃、5min融化后，加入800μl LB液体培养基，28℃低速振荡4-5h；

d.10000 rpm，30sec,去上清，加100μl LB液体培养基，悬浮菌体后涂板；

e.置28℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；

D、农杆菌K599介导的毛状根转化

以大豆品种吉林小粒1号为材料，取种子材料用氯气消毒10小时后，在B₅培养基上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶节处纵横切割数刀，浸在活化的农杆菌K599中侵染30min后，将外植体转至1/2MS培养基上共培生长3天后，再转至1/2MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，取根进行GUS染色分析；

E、胁迫处理及GUS染色

将转基因毛状根浸没在1/2MS培养基、150mM NaCl中进行胁迫处理；3,6,24h后进行GUS染色，以1/2MS培养基中的毛状根作为对照；

F、结果

GUS染色结果表明，在NaCl处理条件下GUS基因表达上调。