[发明专利]用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

环介导等温扩增反应液，23μL/份，其组成如下：

1μL浓度为8U的BstDNA聚合酶，2.5μL的聚合酶缓冲液，浓度为5μmol/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP各1μL，浓度为25μmol/L的上游外引物F3和下游外引物B3各1μL，2μL浓度为100mM的MgSO₄，5μL浓度为10mM的dNTP，5μL浓度为5M的甜菜碱，3.5μL的无菌水；

其中聚合酶缓冲液含有200mM Tris-HCl(pH8.8)，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM的MgSO₄，1％Triton X-100；

所述的引物序列为：

上游外引物F3：CCTTTGCCGCCAGATTCC

下游外引物B3：GCTCCCAAGAGAGAAAGGC

上游内引物FIP：TGGATTACGGCAGGTTTGCGA-CCCGCACATTTCCGAACT

下游内引物BIP：GGCAACAAAGGAAATCGCGGC-TCTTCAAACCGGGCAGCT。

2.一种使用权利要求1所述试剂盒检测支气管败血波氏杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)波氏杆菌DNA的提取

1)、取1mL细菌过夜培养液，5000rpm离心10min，去上清；

2)、加550μL的TE溶液悬浮沉淀，并加50μL 10％SDS溶液，50μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；

3)、加150μL 5mmol/L的NaCl溶液，混匀加150μL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；

4)、用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(三者体积比25∶24∶1)抽提，5000rpm离心10min，将上清液移至干净离心管中，用等体积酚∶氯仿(体积比24∶1)抽提，取上清液移至干净试 管中；

5)、加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，沉淀DNA；

6)、用70％乙醇漂洗沉淀后，洗干，溶解于100μL的TE溶液，-20℃保存，作为模版备用。

(2)进行支气管败血波氏杆菌的环介导等温扩增

在装有23μL的LAMP反应试剂的反应管中加入2μL待检DNA，与65℃恒温水浴锅中放置1个小时，后将水浴锅调至80℃反应5min来终止反应。

(3)结果的观察

反应完毕后取出PCR管，12000转/分离心1分钟，然后观察PCR反应管底部有无白色沉淀，如有沉淀产生则判定为阳性。