[发明专利]小肠结肠耶尔森菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及肠道病原菌中耶尔森菌属的小肠结肠耶尔森菌的分离和鉴定方法，特别涉及利用选择性增菌、选择性分离培养基对应生长的典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验筛选、鉴定包括多种复杂生物型和产毒或非产毒血清型在内的小肠结肠耶尔森的试剂盒、制备和应用。

背景技术

小肠结肠耶尔森菌广泛分布在自然界中，在野生动物和家养的偶蹄动物中（尤其是猪）体内（包括淋巴系统和循环、肠道等部位）寄生或定殖，属于目前已知的动物类肉类制品明确检疫的病原菌，同时，也是能引起食源性传播和暴发的重要病原菌之一。国内的许多实验室（包括临床实验室和公共卫生实验室）在实际工作中无法通过可选择的常规微生物分离方法和材料达到分离的预期效果，反而受制于培养基的批间质控要求繁琐、敏感性和特异性低以及多次对疑似菌落筛选和鉴定所用自动化生化反应试剂材料的昂贵费用，费工费时。本发明是基于传统细菌学技术简化，经提炼、加入创新材料组合成的检测程序，包括对多种复杂样品的预处理和选择性增值，使用选择性平板分离出所有小肠结肠耶尔森菌的典型菌落，结合简易生化和特异性酶-底物反应组合试验同时筛选、鉴定产毒性小肠结肠耶尔森菌的试剂盒和筛选方法，较之现阶段使用的传统分离平板和鉴定技术单纯依赖自动化生化鉴定仪器为主的方法更具有综合成本低、操作简单、快速、无需依赖特殊仪器且有特异性、准确性及阳性预期值高的优点。适用粪便（或者粪便拭子）、食品、环境水样等多种增菌标本中小肠结肠耶尔森菌的同步分离和鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种可利用产毒性小肠结肠耶尔森菌的生物学特性和酶反应试验鉴定的试剂盒、制备和应用。主要解决现有小肠结肠耶尔森菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选结果不够直观的技术难题。本发明针对不同类型标本分别使用2种选择性增菌液及专一性分离平板配合简单的糖生化发酵-动力反应模式和细菌特异性酶-底物反应特征建立一套行之有效的分离和特异性鉴别试验，达到对产毒性小肠结肠耶尔森菌分离、筛选和简易鉴定的效果。

本发明的技术方案为：小肠结肠耶尔森菌分离、鉴定的试剂盒及其制备方法，包括：

1、通用型非选择性增菌液：胰酪胨大豆胨肉汤（TSB）。成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K₂HPO₄ 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.3±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅15分钟（121℃）灭菌后分装225ml/瓶备用。

2、10倍浓缩通用型非选择性增菌液：胰酪胨大豆胨肉汤（TSB）。成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K₂HPO₄ 2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水100ml，加热溶解后矫正pH至7.3±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅15分钟（121℃）灭菌后分装10ml/瓶备用。

3、耶尔森菌冷增菌液：蛋白胨山梨醇胆盐肉汤：动物组织胰化胨5.0g，山梨醇10.0g，磷酸氢二钠8.23g，磷酸二氢钠1.2g，混合胆盐1.5g，氯化钠5.0g，加热溶解后矫正pH至7.6±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅15分钟（121℃）灭菌后分装10ml/管备用。

4、耶尔森菌快速选择性增菌液：替卡西林高氯酸肉汤（TCB）。成分：氯化镁（含6H₂O）60.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，高氯酸1.0g，酵母浸出物1.0g，2%质量百分浓度的孔雀石绿5.0ml，三氯生溶液（用质量百分浓度95%的乙醇配成质量百分浓度0.1%的溶液）1.0ml，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.6±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅15分钟（121℃）灭菌冷却至50℃后加入替卡西林（羟噻吩青霉素，0.1%质量百分浓度水溶液）1.0ml，分装10ml/管备用。