[发明专利]重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株

说明书

技术领域

 本发明涉及一种重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株。

背景技术

 促性腺激素FSH是脑垂体分泌的糖蛋白激素，其分子由一个alpha亚基和beta亚基组成，编码alpha和beta亚基的基因不在同一条染色体上，成熟分子必须在体内翻译之后经历一系列后加工，包括每个亚基的正确折叠、两个亚基结合形成正确的异构二聚体，然后，再经过糖基化获得生物活性。因此，模拟自然过程开发用基因工程生产这FSH技术，难度相当大。正是由于这个原因，目前市场上销售的FSH主要依靠从组织中提取。人类绒毛膜促性腺激素（hCG）具有有一定的FSH活性，其beta亚基在羧基端有一个羧基端肽序列（CTP），使hCG分子其在血液中的清除率明显降低，延长它的生理作用时间，所以hCG具有长效作用。

促性腺激素的基本生理功能是维持卵巢和睾丸的结构和功能，动物实验证明，摘除脑垂体的绵羊性腺萎缩，母羊卵子发育和排卵活动完全停止。但是，注射促性腺激素可以逆转这种生理反应，而且逆转反应的强度随着注射促性腺激素的剂量而增加，高水平的促性腺激素可以诱导超数排卵。注射外源性促性腺激素通常用于提高人和家畜的繁殖性能，在人类辅助生殖和家畜胚胎工程中，通过促性腺激素注射增加排卵数，是必不可少的技术措施。但是，由于脑垂体的来源十分有限，商业上常用的促性腺激素制剂，主要是羊和猪脑垂体的提取物（FSH）、怀孕母马血液提取物（eCG）、孕妇（hCG）和老年妇女（hMG）尿中的提取物。通过提取获得的促性腺激素有许多缺点，纯度和生理效价均不稳定，生产过程也难控制，常常有被病原体污染的危险。用重组DNA技术生产的促性腺激素，可以克服组织提取产品存在的诸多缺点。但是，通过培养基因工程细胞生产促性腺激素，产量通常比生产其它医用蛋白质低，主要技术困难是促性腺激素分子由两个亚基组成，必须在细胞中同时表达两个基因，并同时提纯alpha和beta两种蛋白分子，然后在体外重构杂合二聚体。在这个过程中，细胞生产的亚基分子损失严重，原因是形成正确杂合二聚体的效果很差，即使在最佳的条件下，二聚体的正确组装率也只有25%（Bedows et al. 1992, Ruddon et al. 1996）。

由于促性腺激素的市场在不断扩大，国际上已加强了对这类产品的研究，期望开发出更先进的生产方法。从技术发展趋势来看，最有希望用来大规模生产基因工程促性腺激素的技术是制作单链FSH，即把alpha亚基和beta亚基串联成一个基因，并在细胞中一起表达。若使用hCG的羧基端CTP氨基酸序列将alpha亚基和beta亚基的氨基酸序列串联在一起，FSH有可能单链融合蛋白能变成了长效分子。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株。

本发明所提供的重组人促卵泡成熟素和黄体生成素的基因，命名为rFSH，其基因工程菌命名为X33/rFSH。

X33/rFSH已于2012年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC No.6181。

本发明是这样来实现的，一种重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株，其特征在于由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因，其碱基序列如序列表中序列2所示，以及所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，并有所述重组菌发酵得到重组人促卵泡成熟素rFSH；所述基因的重组表达载体为在载体pPICZαA的多克隆位点插入序列表的序列2所示的DNA得到的重组质粒；所述重组菌为将权利要求3所述重组质粒导入毕赤酵母X-33得到的重组菌；所述重组菌为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）x33/ rFSH CGMCC No.6181。

本发明的方法生产的重组人促卵泡成熟素rFSH具有长效、稳定等优点，适于用作人和动物的促排卵激素使用。

附图说明

图1为本发明基因序列串联示意图。

图2为本发明重组人促卵泡成熟素rFSH表达载体构建流程图。

图3 为本发明重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得，

实施例1、rFSH基因的核苷酸序列设计与重叠PCR扩增