[发明专利]一种菁类荧光染料

说明书

技术领域

本发明涉及一种可用于生物荧光标记的菁类荧光染料，具体地讲，本发明涉及一种可以在温和反应条件下制备的荧光染料，其制备方法以及在生物样品染色中的用途。

背景技术

荧光染料已经被广泛应用于生命科学研究和临床医学诊断。在流式细胞分析中，荧光染料与细胞中的核酸物质进行结合后，通过激光照射区时，发出荧光和多角度的散射光。通过对这些荧光和散射光信号的检测，可以获得关于细胞的结构和理化参数的大量信息。

临床医学诊断中，通常把人体外周血中的正常白细胞分为淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等。白细胞在病理情况下，其形态、数量比例以及细胞内部的核酸成分都会发生很大变化。另外，人体外围血中的红细胞通常为成熟的不含RNA的红细胞，在病理情况下，会出现未成熟的含RNA的网织红细胞。通过荧光染料对细胞的DNA/RNA核酸进行特异性染色，利用荧光检测技术可以有效筛查出这些异常细胞。

早期应用的染料包括新亚甲蓝（NMB）、亮甲苯蓝（BCB）、派诺宁Y、溴乙锭等。它们通过嵌入或静电吸引与核酸分子形成复合物，从而可以在显微镜下观察增强后的荧光。但是这些染料自身也可以形成染料复合物，不能明显区别于染料与核酸形成的复合物，造成高的荧光背景干扰。同时，这些染料的荧光量子效率较低，降低了荧光增强的程度，影响检测结果的准确性。

美国专利3883247公开了一种白细胞五分类方法，它是通过吖啶橙对白细胞核酸进行染色，通过不同的白细胞亚类红色和绿色荧光量的差异来对白细胞进行分类。该方法采用的吖啶橙可以和核酸形成复合物，使荧光增强。这类染料分子相互之间在能量传递的过程中可能会导致光淬灭，使得染料核酸复合物没有荧光发出，影响检测结果真实性。同时在流式细胞分析仪中，吖啶橙和塑料管路有较强的作用，会增加背景荧光强度。为了清除测试后残留的染料和保证测试结果的准确性，需要仪器进行长时间的管路清洗，这就降低了仪器的分析效率。

美国专利4882284公开了一种白细胞五分类方法，它是通过采用非溶血的方法利用噁嗪类荧光染料对血细胞中的各种细胞进行染色，然后通过不同细胞的前向散射光、侧向散射光和红色荧光强度来对白细胞进行分类。这些染料的荧光量子效率较低，降低了荧光增强的程度，影响检测结果的准确性，同时由于需要测定红细胞、白细胞和血小板，则一些异常红细胞如大红细胞等会影响白细胞准确计数。

目前使用的菁类荧光染料，如由美国的Glazer 等开发的对dsDNA 具有高度亲和力的不对称菁染料TOTO（噻唑橙二聚体）、YOYO（噁唑黄二聚体）、TOTAB、TOTIN（噻唑橙异二聚体），以及在这个基础上衍生出的不对称单亚甲基菁染料TO-PRO-3、PO-PRO-2和BO-PRO-2等[K.M. Sovenyhazy, J.A. Bordelon, J.T. Petty. Nucleic Acids Res, 2003, 31, 2561]，它们的吸收和发射都在近红外区 (670-1000 nm)，但这类染料的分子结构复杂，合成路线较长，纯化处理耗时长且收率较低，因而价格高昂，限制了其使用范围。

因此需要开发新的菁类荧光染料，该类荧光染料具有以下特点：合成步骤少，合成条件温和，纯化处理方式简单，产品收率高，光稳定性高，具有一定的细胞膜通透能力，同时具有低荧光背景和对核酸的特异性识别能力。 

发明内容

本发明的目的：本发明一种菁类荧光染料是针对现有技术存在的不足，在其基础上进行多次改进和实验，而得到的一类具有合成步骤少，合成条件温和，纯化处理方式简单，产品收率高，光稳定性高，具有一定的细胞膜通透能力，同时具有低荧光背景和对核酸的特异性识别能力的菁类荧光染料。

本发明的内容：本发明公布了一种具有下列结构通式I的菁类荧光染料：

其中

X为C(CH₃)₂、O或者S；

R1选自H、OH、C1-18烷基、苯基；

R2选自H、OH、NHR5、N(R5)2；

R3选自苄基、C3-18烯基、C3-18炔基，其中苄基由选自以下的取代基任选取代：卤素、羟基、巯基、氰基、硝基、烷基、芳基、烷氧基、杂环基、卤代烷基、氨基、烷基氨基、酰氨基、羧基；

R4选自C3-18烯基、C3-18炔基；

R5选自C1-18烷基、C3-18烯基；

Y-为负离子。

本发明的技术方案：本发明一方面提供了一种菁类荧光染料，所述荧光染料可以通过下述步骤得到：