[发明专利]一种牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法。

背景技术

牡蛎是福建省大宗特色水产品，每年产量约占全国产量 1/2，不仅产量丰富，而且具有较高的营养价值和药用价值，其软体部分蛋白质含量高达50%，素有“海洋牛奶”之称，同时含有丰富的ω－3多不饱和脂肪酸。但由于牡蛎体内富含浸出物，体表被覆多种黏液，尤其是开壳后的牡蛎，更有利于微生物繁殖，给牡蛎的食用品质和安全品质带来潜在的隐患。

牡蛎作为滤食性的海洋贝类，其鳃部在摄食中富集营养物质的同时也聚集了大量微生物，在开壳后，由于该部位营养丰富，微生物大量繁殖而导致牡蛎发酸发臭，最终失去食用价值。很多学者也因此而致力于研究牡蛎保鲜技术和保鲜过程中微生物的变化规律，曹荣发表了“一种复合型生物保鲜剂在牡蛎保鲜中的应用研究”和“气调包装对太平洋牡蛎冷藏保鲜效果的研究”， 庄荣玉发表了“净化后的褶牡蛎细菌菌相分析” 的文献， 在文献中分别采用涂膜保鲜和气调保鲜技术，用传统的分离培养，并分析了牡蛎中的优势菌。该方法工作繁重，耗时长，未有效分析肠道和鳃部菌群的变化。目前关于保鲜牡蛎微生物的研究仍然以传统的分离培养为主，该方法存在以下四个方面的问题：一是自然界的微生物有70%是无法培养的，而鳃部菌群复杂，有些是不可培养的；二是该方法的分离培养周期长，操作繁琐，需要耗费大量的人力物力；三是该方法无法真实而直接反映牡蛎鳃部菌群原始状态，无法准确分析牡蛎腐败菌群；四是保鲜方法大部分是对牡蛎外部菌群的控制，特别是鳃部的微生物，而目前的研究在分析不同保鲜技术对菌群影响时，对整个牡蛎机体的菌群进行传统分离培养，导致大部分肠道菌群干扰分析的准确性。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术是 Muyzer 等人在 1993 年首次应用于微生物群落结构研究，并在之后十几年内得到迅速的发展和完善。DGGE是一种可以将长度相同但核苷酸序列不同的双链 DNA 片段分开的一种方法，进而研究微生物群落结构的变化。DGGE对于研究微生态系统的菌群具有高通量，快速，有效，准确等优点。

发明内容

本发明是以牡蛎为研究对象，解决传统分离培养方法应用于研究微生物所带来的不足，而建立的一种牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法。

为实现上述目的，本发明的具体步骤如下：

本发明的分析方法包括DNA提取、巢式PCR扩增、变性梯度凝胶电泳DGGE、对DGGE指纹图谱进行聚类分析；其中所述DNA提取的步骤如下：

（1）取牡蛎鳃部组织1～5g，剪碎后，加入50mL的生理盐水中，150rpm震荡20min，200目绢布过滤，取滤液800rpm离心10min，去沉淀，清液8000rpm离心10min，收集菌体重悬浮于TE中，-20℃保存备用；

（2）菌体样品经裂解、抽提、异丙醇沉淀和乙醇洗涤，所得DNA沉淀溶解于TE，-20℃保存备用；

步骤（2）所述的裂解采用溶菌酶和SDS：首先在菌体样品中加入20～100μL 10mg/mL的溶菌酶，37℃保温1h，然后依次加入100μL 10% SDS和0.3～0.5mg蛋白酶 K干粉，55℃保温1h；

步骤（2）所述的抽提参数为：氯仿:异戊醇v/v=24:1抽提，2000～5000rpm离心5～10min，上清用酚:氯仿:异戊醇v/v=25:24:1抽提，3000～8000rpm离心5～10min，上清用氯仿:异戊醇v/v=24:1再次抽提，10000 rpm离心5～10min，吸取上清，用于异丙醇沉淀。

DNA提取的步骤中所提取的DNA无需进一步纯化，直接用于巢式PCR扩增。

所述巢式PCR扩增，分两个步骤：第一步采用细菌通用引物对27F，1492R进行16SrDNA扩增；第二步采用带40GC夹子的引物对338F-GC，518R进行V3区扩增。

所述巢式PCR扩增，对第一步的扩增产物稀释50～100倍，取1μL稀释液作为第二步扩增的模板。

取V3区扩增产250～350ng，用于DGGE上样，DGGE胶的浓度为8%的变性聚丙烯酰胺胶，变性梯度范围34%～52%，设定电泳条件：60℃，150V，390min，电泳缓冲液为1×TAE，电泳结束后染色25～30min，并立即进行拍照和切胶用于条带分析。

所述变性聚丙烯酰胺胶以7M尿素和40%去离子甲酰胺为变性剂。