[发明专利]一种HCV的DNA疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和感染免疫领域，具体涉及一种丙型肝炎病毒（hepatitis C Virus,HCV）的DNA疫苗，本发明还涉及该疫苗的制备方法。

背景技术

我国是HCV高感染率国家之一，HCV感染是导致慢性肝炎、肝癌、肝硬化的主要因素之一，严重影响人类健康。目前尚无有效的治疗和预防性HCV疫苗。

HCV的最终控制将取决于疫苗预防。在抵挡病毒的入侵过程和免疫抵抗HCV攻击人体细胞中，特异性中和性抗体和细胞免疫起到了非常重要的作用。HCV包膜(envelope)糖蛋白（E1和E2）能够诱使机体产生中和抗体，阻断病毒的入侵。包膜E2蛋白是诱导中和抗体的主要靶抗原，虽然E2蛋白的变异性较高，但近年在E2中鉴定出了一系列保守的中和抗体表位，这给HCV疫苗的开发带来了新希望。DNA疫苗已经广泛地应用于乙型肝炎病毒，狂犬病毒和人类获得免疫缺陷病毒的预防和治疗中。它的基本原理是将编码抗原的基因片断直接通过肌肉注射或基因枪等方法直接导入宿主体内，DNA体内摄取后，抗原蛋白的转录后修饰及立体构象和自然感染时所产生的抗原蛋白完全一样，抗原性好，这些内生（源）性蛋白抗原经MHCⅠ类途径呈递，诱导产生细胞毒性淋巴反应（CTL）效应性CD8+T细胞；可溶性抗原蛋白释放到细胞外后，被专职抗原递呈细胞（APC）摄取，然后经MHCⅡ类途径呈递，活化CD4+T细胞，及其随后产生抗体的B细胞活化，因此DNA免疫可全面诱导机体的免疫反应。

HCV病毒体基因编码3011个氨基酸的长开放读码框。在病毒复制中，氨基端有三个蛋白(C、E1、E2／NS1)，羧基端有四个蛋白(NS2、NS3、NS4、NS5)（Pwalotsky JM，Gastroenterology，2002，122(6)：1554—1568）。HCV E区包膜糖蛋白是诱导中和抗体的主要抗原区，故HCV E区及其编码的抗原是HCV疫苗研究的重点（Fournillier,et al.J.Virol,2001;75:12088）。HCV的包膜蛋白El和E2在病毒识别、粘附、侵入宿主细胞过程中发挥关键作用。E1E2含有T、B细胞表位，可以诱导保护性免疫反应，是保护性抗原。

糖基化是蛋白翻译后的重要修饰加工环节，可以诱导蛋白空间构象正确折叠，增加蛋白的酶亲水性，稳定性，并且可以调节蛋白的抗原性。E1和E2上含有多个保守的N-糖基化位点，即在HCV的不同基因型中N-糖基化位点均是保守存在的。其中E1有5个N-糖基化位点，E2上有11个（Goffard,A et al.，J.Virol,2005，79:8400-8409；Slater-Handshy et al，Virology,2004,319(1):36-48）。

尽管E1E2的功能和作用已经比较清楚，然而E1E2的免疫保护性仍然较低。另外，HCV的基因编码的E1和E2蛋白的分子量大小分别是：31KD和70KD，其原核表达蛋白不能形成蛋白质的糖基化，且表达困难，而真核表达的产量较低且纯化困难。因而E1E2在实际免疫保护中的应用受到了限制，不利于推广。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对上述不足，提供一种具有更强免疫保护性的E1E2突变体。

本发明的第二个目的在于提供能够产生上述突变体的DNA疫苗。

本发明的第三个目的在于提供上述DNA疫苗的制备方法。

为实现上述目的，本发明首先提供一种HCV包膜糖蛋白E1E2突变体，其为E1蛋白和E2蛋白的融合蛋白，并且E1蛋白的第2个糖基化位点由N突变为D，E2蛋白的第8个糖基化位点由N突变为D。即，该突变体是E1E2蛋白的N-糖基化位点突变，氨基酸由原来的天冬酰胺突变为天冬氨酸得到，具体所述突变是E1E2蛋白的E1-N209SS突变为E1-D209SS，E2-N430AS突变为E2-D430AS。所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。该突变体可诱导产生比野生型HCVE1E2更强的特异性细胞免疫（CTL）和中和性抗体（neutralizing antibody,NAb）。

进一步本发明提供所述HCV包膜糖蛋白E1E2突变体的基因。为促进构建得到的DNA疫苗的激活功能，优选对该基因序列进行CpG修饰，连接上CpG序列，较佳的CpG序列为GACGTT。较佳的所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明所述的核酸疫苗（DNA疫苗）即包含上述基因，其被构建于表达载体上，例如病毒载体，优选所述载体为pVAX-1（美国FDA认可用于人体的DNA疫苗的载体）。