[发明专利]psy、pds和zds基因三价融合植物表达载体及构建方法

权利要求书

1.一种psy、pds和zds基因三价融合植物表达载体，其特征在于：所述psy、pds和zds基因三价融合植物表达载体的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种psy、pds和zds基因三价融合植物表达载体的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤：

步骤10、分别根据克隆的草莓果实类胡萝卜素生物合成途径重要基因psy、pds、zds的cDNA全长序列，结合植物双元表达载体pBI121载体上的酶切位点，设计3对含有不同酶切位点的引物；并利用这3对引物，以草莓总RNA为模版，通过RT-PCR法分别克隆草莓psy、pds和zds的开放阅读框，连接到pMD18-T simple载体上，得到重组质粒pMD18-psy、pMD18-pds和pMD18-zds；

步骤20、设计合成一含有酶切位点和2个口蹄疫病毒2A序列的一序列a，所述序列a如SEQ ID NO.2所示；

步骤30、将序列a插入到植物双元表达载体pBI121的XbaⅠ和SacⅠ酶切位点之间，得到改造后的重组质粒pBI1212A；

步骤40、将重组质粒pMD18-psy上的psy基因插入到重组质粒pBI1212A的XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pBI2A2Apsy；

步骤50、将重组质粒pMD18-zds上的zds基因插入到重组质粒pBI2A2Apsy的Bsp1407Ⅰ和KpnⅠ酶切位点之间，经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后，构建成psy和zds基因二价融合植物表达载体pBI2A2Apsy-zds；

步骤60、将重组质粒pMD18-pds上的pds基因插入到重组质粒pBI2A2Apsy-zds的SalⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后，构建成psy、pds和zds基因三价融合植物表达载体pBI2A2Apsy-pds-zds。

3.根据权利要求2所述的psy、pds和zds基因三价融合植物表达载体的构建方法，其特征在于：

所述步骤30具体为：利用经限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ对植物双元表达载体pBI121和序列a分别进行双酶切，分别回收长度为190bp的序列a目的片段以及植物表达载体pBI121的线性大片段，并使用T4DNA连接酶进行连接，最后得到含有酶切位点和2个2A序列的重组质粒pBI1212A。

4.根据权利要求2或3所述的psy、pds和zds基因三价融合植物表达载体的构建方法，其特征在于：

所述步骤40具体为：所述重组质粒pMD18-psy经限制性内切酶Xba Ⅰ和BamH Ⅰ消化后，从中回收的长度为1194bp的psy基因片段，与经Xba Ⅰ和BamH Ⅰ消化的重组质粒pBI2A2A中回收的大片段基因经T4DNA连接酶连接，再进行限制性内切酶酶切鉴定，最后得到重组质粒pBI2A2Apsy；

所述步骤50具体为：所述重组质粒pMD18-zds经限制性内切酶Bsp1407Ⅰ和Kpn Ⅰ消化后，将从中回收的1710bp的zds基因片段，与经Bsp1407Ⅰ和Kpn Ⅰ消化的重组质粒pBI2A2Apsy中回收的大片段基因通过T4DNA连接酶连接，连接完成后再进行PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定，构建成psy和zds基因二价融合植物表达载体，即重组质粒pBI2A2Apsy-zds；

所述步骤60具体为：所述重组质粒pMD18-pds经限制性内切酶Sal Ⅰ和Xho Ⅰ消化后，将从中回收的1704bp的pds基因片段，与经Sal Ⅰ和Xho Ⅰ消化的重组质粒pBI2A2Apsy-zds中回收的大片段基因通过T4DNA连接酶连接，连接完成后再进行PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定，最后构建成psy、pds和zds基因三价融合植物表达载体pBI2A2Apsy-pds-zds。