[发明专利]仅鼻拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法

权利要求书

1.一种拟人吸烟大鼠免疫功能评价指标的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以吸空气大鼠的血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液作为正常对照组，经鼻连续抽吸卷烟的大鼠的血清、脾淋巴细胞、脾淋巴细胞培养上清液、腹腔巨噬细胞及血液作为吸烟组；

(2)利用MTT增殖法检测步骤(1)中各组脾淋巴细胞增殖能力，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；

(3)利用鸡红细胞吞噬实验法检测步骤(1)中各组腹腔巨噬细胞吞噬百分比和吞噬指数，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；

(4)利用ELISA法检测步骤(1)中各组脾淋巴细胞培养上清液和血清中IL-6及TNF-α细胞因子浓度，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；

(5)检测步骤(1)中各组血清中总Ig含量、IgG含量及IgE含量，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃；

(6)利用瑞氏染液染色法检测步骤(1)中各组血液中白细胞分类计数，比较各组检测结果，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该指标作为评价指标，反之，放弃。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)具体步骤包括：将步骤(1)中各组脾淋巴细胞1×10⁶个/ml加入培养板，每孔0.1ml，再加入刺激细胞伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白终浓度为10μg/ml，作为加刺激细胞组，并设不加伴刀豆蛋白的阴性对照组和不加脾淋巴细胞和ConA的空白对照组，均置于5％CO₂培养箱，37℃培养68h，每孔加入10μl MTT溶液，放回培养箱孵育后加入MTT溶媒100μl/孔，在570nm波长处测OD值，淋巴细胞的增值能力以刺激指数表示，刺激指数＝加刺激细胞组OD值/阴性对照组OD值，比较各组刺激指数，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该刺激指数作为评价指标，反之，放弃。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)具体步骤包括：将步骤(1)中各组纯化的腹腔巨噬细胞用RPMI-1640培养液配制成10⁶个/ml，加入5％的鸡红细胞悬液0.04ml，其中鸡红细胞10⁷个/ml，置于37℃水浴中孵育15-30min，离心，弃上清，将沉淀的鸡红细胞涂片，干燥后甲醇固定，瑞氏染色，显微镜下观察100个巨噬细胞，计数吞噬百分比和吞噬指数，吞噬百分率＝吞有鸡红细胞的巨噬细胞数×100/100个巨噬细胞，吞噬指数＝100个巨噬细胞中所吞噬的鸡红细胞数×100/100个巨噬细胞，比较各组吞噬百分比和吞噬指数，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该吞噬百分比和吞噬指数作为评价指标，反之，放弃。

4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)具体步骤包括：将步骤(1)中各组脾淋巴细胞1×10⁶个/ml加入培养板，每孔1ml，再加入伴刀豆蛋白，使伴刀豆蛋白终浓度为10μg/ml，并设不加伴刀豆蛋白的阴性对照组和不加脾淋巴细胞和ConA的空白对照组，均置于5％CO₂培养箱，37℃培养68h，离心收集上清液即脾淋巴细胞培养上清液，收集的上清液与步骤(1)中各组大鼠血清中IL-6与TNF-α采用大鼠细胞因子检测试剂盒进行ELISA法检测，细胞因子浓度依照已知浓度的标准品绘制的标准曲线进行计算，比较各组细胞因子浓度，分析相互的显著性差异情况，若吸烟组与正常对照组相比有显著性差异，筛选出该IL-6和/或TNF-α细胞因子作为评价指标，反之，放弃。