[发明专利]草莓psy和pds基因二价植物表达载体及构建方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种psy和pds基因二价植物表达载体及构建方法。

【背景技术】

类胡萝卜素（Carotenoids）是自然界中广泛存在的色素，是植物、细菌、真菌光合反应必不可缺的成分，在高等植物中，类胡萝卜素主要存在于叶片的叶绿体以及许多花和果实的有色体中，使花和果实呈亮黄色、橙色或红色。越来越多的医学研究表明，除了不少类胡萝卜素是维生素A的前体外，许多类胡萝卜素在猝灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等保护人类健康方面起着重要的作用。因此类胡萝卜素既是决定水果、蔬菜内在营养品质的重要指标，也是影响果实外观品质和花卉观赏价值的重要因素，了解植物类胡萝卜素积累的特点与代谢的生理机制，对于进一步调控植物类胡萝卜素的生物合成途径，改善园艺植物的食用品质和观赏品质具有重要的意义。八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase，PSY)和八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase，PDS)是类胡萝卜素生物合成过程中关键酶。PSY是类胡萝卜素生物合成过程中关键酶之一，它催化两个牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)缩合形成八氢番茄红素，八氢番茄红素是整个类胡萝卜素合成途径中第一个类胡萝卜素分子。由于PSY是植物中类胡萝卜素生物合成的一个限速酶，所以由GGPP生成八氢番茄红素这一步骤已成为类胡萝卜素代谢途径的“瓶颈”，而其编码的基因也成为应用基因工程技术改善植物类胡萝卜素含量的首选目的基因。PDS是植物类胡萝卜素合成中去饱和的非常重要的一类酶，参与线状类胡萝卜素生物合成。PDS催化八氢番茄红素连续两次脱氢生成ζ-胡萝卜素，然后在ZDS催化下，ζ-胡萝卜素脱氢生成链孢红素继而进一步脱氢生成番茄红素，PDS是类胡萝卜素合成途径中的重要限速酶。

将外源基因导人植物基因组是植物分子生物学和遗传工程的一项基本技术。基因转化首先必须构建含有目的基因的植物表达载体，植物表达载体的构建是一个十分复杂的过程，要综合考虑了目的基因的编码区和植物表达载体的酶切位点及翻译蛋白移码问题基础上，涉及到多次大分子重组，每次重组过程又包括质粒提取、酶切、回收、连接、转化和筛选鉴定等工作。由于生物体内的代谢途径常常涉及多步反应，除了需要单个酶催化，更需要两个或多个酶共同催化。因此将多基因转化到同一植物中，就显得很有必要了。多基因表达载体构建与转化技术的诞生使多个目的基因导入植物基因组中并在植物中表达得以实现。构建多表达框载体策略是多个目的基因的两端均具有各自的启动子、增强序列、终止子等转录和翻译调控元件，将它们串联在一起共同组建于一个表达载体中，当这种表达载体构建好后，只要通过一次转化就可以方便而成功地获得多价基因同时表达的转基因植物。目前已经广泛应用各类生物当中。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种草莓psy和pds基因二价植物表达载体，通过psy和pds基因协同表达能够提高草莓果实类胡萝卜素含量，并为研究草莓类胡萝卜素生物合成途径中各种代谢酶的调控功能以及类胡萝卜素积累特点和代谢机制奠定技术平台。

本发明是这样解决的技术问题之一的：

一种草莓psy和pds基因二价植物表达载体，所述草莓基因二价植物表达载体为草莓的psy和pds基因串联二价植物表达载体，所述psy和pds基因分别具有独立转录调控元件和表达盒，所述表达载体的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明要解决的技术问题之二，在于提供一种草莓基因二价植物表达载体的构建方法，该构件方法大大提高了载体构建成功的概率，节约构建载体的时间，缩小工作量；通过psy、pds基因协同表达能够提高草莓果实类胡萝卜素含量。

本发明是这样解决的技术问题之二的：

一种草莓psy和pds基因二价植物表达载体的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

步骤10、分别根据已克隆的草莓psy和pds基因的cDNA全长序列，结合植物双元表达载体pCAMBIA1301和pBI121载体上的酶切位点，设计2对含有不同酶切位点的引物；并利用这2对引物，以草莓总RNA为模版，通过RT-PCR法分别克隆草莓psy和pds的开放阅读框，连接到pMD18-T simple载体上，得到重组质粒pMD18-psy和pMD18-pds；