[发明专利]一种生产木糖异构酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组酶。具体是应用微生物工程菌生产重组木糖异构酶。

背景技术

木糖异构酶(Xylose Isomerase EC5.3.1.5)是具有变构作用的酶。木糖异构酶的主要作用是催化D-木糖(醛戊糖)与D-木酮糖(酮戊糖)相互转换的酶，也作用于D-萄萄糖得到D-果糖。木糖异构酶主要应用于果葡糖浆工业、生产半纤维素乙醇工业、作为食品添加剂和饲料添加剂等。不同的用途对于木糖异构酶作用的适合温度和pH有着不同的要求。当前市场上的异淀粉酶产品是来源于天然菌株生产的木糖异构酶，由于天然菌株中的木糖异构酶基因是由单种木糖异构酶基因编码，其适合反应温度范围和适合反应pH范围窄。所以，当前的木糖异构酶产品不能满足和适合于当前市场的需求。

毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有兼性需氧的特性，适合于固态厌氧发酵生产重组酶。

发明内容

当前市面上只有这些酶的单种酶，尚没有混合表达这些酶的菌种和混合酶产品。来源于栖热菌(Thermus)的木糖异构酶最适pH 7，最适合温度90℃，在80至95℃和pH6.2至7的条件下有80％的它在最适温度和最适pH条件的酶活性；来源于链霉菌(Streptomyces)的木糖异构酶最适pH 8，最适合温度80℃，在68至86℃和pH6.8至8.5的条件下有80％的它在最适温度和最适pH条件的酶活性；来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的木糖异构酶最适pH 6，最适合温度50℃，在37至60℃和pH4.8至7.2的条件下有80％的它在最适温度和最适pH条件的酶活性。从上述可见，若将上述这三种不同来源的木糖异构酶制备成混合酶产品，那么这种混合酶的的适合反应温度和pH范围将明显较其中的单种酶广。

本发明应用分子生物学技术构建含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架、链霉菌的木糖异构酶基因表达框架和大肠杆菌的木糖异构酶基因表达框架(说明.表达框架：启动子-信号肽-基因-转录终止子)的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌。用含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合木糖异构酶。

本发明所采用的技术方案是：

1.克隆酶基因：应用分子生物学技术，从栖热菌(Thermus)基因组中扩增木糖异构酶基因，从链霉菌(Streptomyces)基因组中扩增木糖异构酶基因，从大肠杆菌(Escherichia coli)基因组中克隆木糖异构酶基因。

2.获得构建表达载体所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子序列和抗性基因。

3.构建如附图1的毕赤酵母表达载体、附图2的酿酒酵母表达载体和附图3的枯草芽孢杆菌表达载体。

4.应用电转化方法将含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母基因组；应用电转化方法将含三种木糖异构酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母基因组；应用电转化方法将含三种木糖异构酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌基因组。用PCR和DNA序列测定方法验证重组子。分别筛选高表达木糖异构酶的毕赤酵母重组子、酿酒酵母重组子和枯草芽孢杆菌重组子作为含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌。

5.发酵含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合木糖异构酶。

本发明构建含三种木糖异构酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌生产重组混合木糖异构酶的优点体现于：

(1)为市场提供适合反应温度范围广和适合反应pH范围广的木糖异构酶产品。

(2)取代分别发酵含栖热菌的木糖异构酶基因表达框架的菌株生产木糖异构酶，发酵含链霉菌的木糖异构酶基因表达框架菌株生产木糖异构酶，发酵含大肠杆菌的木糖异构酶基因表达框架的菌株生产木糖异构酶。即不仅提高了产品的性能并且实现用一个发酵工序生产三种木糖异构酶取代用多个工序分别生产三种木糖异构酶，达到节省了原材料、能耗和人力资源的作用。