[发明专利]一种生产葡萄糖淀粉酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组蛋白。具体是应用微生物工程菌生产重组葡萄糖淀粉酶。

背景技术

葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase，(EC.3.2.1.3.)]又称糖化酶，它能把淀粉从非还原性未端水解α-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，糖原的非还原木端释放β-D-葡萄糖。应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。当前市场上的葡萄糖淀粉酶产品是来源于天然菌株生产葡萄糖淀粉酶。但是，由于当前的酶产品是来源于单种酶基因编码，适合反应温度范围和适合反应pH范围窄，不能满足不同用途对于酶的多种适合反应温度和适合反应pH范围的需求。

由于葡萄糖淀粉酶有多种来源，那么，不同来源的葡萄糖淀粉酶的基因序列可不相同，不同来源的葡萄糖淀粉酶的理化特性可不相同。毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有兼性需氧的特性，适合于固态厌氧发酵生产重组酶。

发明内容

根据葡萄糖淀粉酶有多种来源，不同来源的葡萄糖淀粉酶的基因序列可不相同，不同来源的葡萄糖淀粉酶的理化特性可不相同，如果将某些不同理化特性的葡萄糖淀粉酶基因重组于同一个细胞的基因组进行表达，那么，所表达的混合葡萄糖淀粉酶将具有理化特性多样性，即具有较广的适合反应温度和pH。这种混合酶将比其中单种酶的使用价值高。

来源于曲霉(Aspergillus)的葡萄糖淀粉酶最适合pH 4.6，最适温度70℃，在pH2.4-7.5和65至80℃的温度下有≥60％的酶活性；来源于毛壳菌(Chaetomium)的葡萄糖淀粉酶最适pH5.6，最适温度80℃，在pH4-6.8和65-88℃有≥60％的酶活性；来自于酵母(Yeast)的葡萄糖淀粉酶最适合pH 7.2，最适温度是40℃，在pH 6-8.6和30-55℃有≥60％的酶活性。由于这三种酶的功能相同，但理化特性有异，所以，这三种在毕赤酵母或酿酒酵母或枯草芽孢杆菌中表达的混合葡萄糖淀粉酶的使用价值将高于其中的单种基因编码的葡萄糖淀粉酶。即这种混合酶的用途将比其中的单独酶广。若分别用不同的菌株来表达这三种酶，其生产成本将高于用一个菌株同时生产这三种酶的混合酶。本发明构建含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌，生产重组混合葡萄糖淀粉酶。

本发明所采用的技术方案是：

1.克隆酶基因：应用分子生物学技术，分别从曲霉基因组、毛壳菌基因组和酵母基因组中扩增葡萄糖淀粉酶基因。

2.获得应用于表达载体构建所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子和抗性基因。

3.构建如附图1、附图2和附图3的含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体。

4.将含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母；将含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母；将含曲霉的葡萄糖淀粉酶基因表达框架、毛壳菌的葡萄糖淀粉酶基因表达框架和酵母的葡萄糖淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌。[说明.表达框架：启动子-信号肽-基因-转录终止子]