[发明专利]玫瑰红鹅膏发酵菌丝体中肽类毒素的发现

说明书

技术领域：

本发明研究了玫瑰红鹅膏发酵菌丝体中的肽类毒素，并提供发酵制备方法及条件，研究表明玫瑰红鹅膏菌丝体含有α-鹅膏毒肽和β-鹅膏毒肽。该研究为毒素获得提供新的资源。 

背景技术：

鹅膏菌是一个世界性分布的大属，有毒蘑菇中最重要的一类,目前已定名的约有500多种。该属属于担子菌亚门（Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycetes）、伞菌目（Agaricales）、鹅膏科（Amanitaceae）、鹅膏属（Amanita Pers.:Gray）。鹅膏菌中主要的毒素为肽类毒素，共有3大类22种，分别为鹅膏毒肽（amatoxins）9种、鬼笔毒肽（phallotoxins）7种和毒伞素（virotoxins）6种。肽类毒素由于独特的生物学特性，目前广泛应用于生物学、医学、遗传学、生物化学、基因工程，病毒等研究领域，人们希望能通过对其毒性成分和药理学研究找到一种理想的药物，使其成为治病的良药，这也是当前摆在药物学和菌物学工作者面前的一项重要的研究课题。在生物学方面，鹅膏毒素作为研究分子生物学的一种工具。 

由于鹅膏属绝大多数种是外生菌根真菌，很难人工培养，毒素基本来源于野外采集的子实体。毒素来源美国Sigma公司每毫克价格在12～14万美元。由于鹅膏属在真菌中的关键性地位以及其毒素的特殊性，因此人工培养鹅膏菌的努力从来没有停止过。 

发明内容：

本发明采用了常规已知的方法制备玫瑰红鹅膏发酵菌丝体，具体如下： 

（1）最适培养基（改良PDM）：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸氢氨0.5g/L，氯化钙0.05g/L，硝酸钾0.1g/L，麦芽汁（12波美度）120ml，维生素B10.01g/L。 

（2）菌种培养：斜面菌种于26℃恒温培养箱培养10d后，将适量菌丝接入最适培养基中，然后置于恒温振荡器上，150r/min振荡培养10d。 

摇瓶发酵：250mL三角瓶装100mL培养液，接种量5%（v/v），置于26℃恒温振荡器上，150r/min振荡培养25d。 

本发明采用了常规已知的方法检测玫瑰红鹅膏发酵菌丝体中的肽类毒素，方法和结果如下： 

1.实验方法 

（1）粗毒液的制备：菌种培养完成后，将发酵液过滤，收集滤渣和滤液，把菌丝体在60℃下烘干后研磨。取1g研磨后的菌丝体粉末，溶于10ml 50%甲醇中，室温下振荡抽提24h，8000r/min离心收集上清液。沉淀以10ml 50%甲醇室温下振荡抽提24h 8000r/min离心收集并合并上清液。用石油醚去脂两次，然后冷冻干燥，冻干的样品用超纯水溶解，再用0.22um的微孔滤膜过滤，得到鹅膏粗毒液。 

（2）毒素的分离纯化：HPLC测定参数 使用安捷伦1100高效液相色谱仪分离梯度模式为：0→15min，B 0→5%，A 100%→95%；15→35min，B 5→80%，A 95%→20%；35→40min，B 80%，A 20%；40-45min，B 80→100%，A 20→0%；45-50min，B 100%；50→55min，B 100→0%，A 0→100%并保持10min；纯 化梯度模式：与分离梯度模式相同。检测波长：295nm；柱温：40℃；流速：分析柱：lmL/min；半制备柱：2mL/min。进样量：分析柱：10μL，半制备柱：lmL。 

HPLC分析先在半制备柱上进行毒素的分离和纯化，得到5种化合物，冷冻干燥后,用HPLC分离纯化再用液相色谱质谱联用仪进行鉴定。 

2.实验结果 

液相保留时间，因不同的分离条件和不同的色谱柱，保留时间有一定的差异，但是各个化合物在液相上的出峰顺序保持不变。同时根据液相色谱质谱联用仪和内标法确定化合物。 

化合物1 在分析柱上检测结果（如说明书附图1，图1化合物1的HPLC图谱图）所示，检测化合物1保留时间是11.41min，纯度较高。电喷雾质谱[M+Na]峰是941，MW是918（如说明书附图2，图2化合物1的电喷物图谱图），。根据色谱保留时间和分子量，判断组分为α-鹅膏毒肽 (α-AMA),分子式为C₃₉H₅₄N₁₀O₁₄S。