[发明专利]利什曼原虫液体培养基及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及黑热病疫情监测和黑热病诊断的液体培养基技术领域，是一种利什曼原虫液体培养基及其制备方法。

背景技术

黑热病是我国《传染病法》规定的乙类传染病之一，是由利什曼原虫引起的一种自然疫源性寄生虫病，白蛉是传播媒介，患病的人和动物是主要传染源；有些地方的传染源和传播媒介还没有查明。2012年WHO报告，利什曼病包括黑热病，广泛分布于88个国家和地区，每年新增病例2百万，总病例已达到1.2亿，有3.5亿人处在该病的威胁中。近些年全世界的黑热病患者人数呈上升趋势，我国和印度的黑热病病人约占世界利什曼病的30%。随着石油、农业和旅游开发，进出疫区的人员日趋增加，增加了黑热病向外扩散传播的机会。由于治疗不彻底或治疗方案不合理，抗药性利什曼原虫的分布范围有扩大趋势。

培养分离利什曼原虫不仅是判断黑热病的重要标准之一，而且是深入开展防治研究工作的基础。3N培养基培养分离利什曼原虫是世界卫生组织（WHO）和我国卫生部黑热病诊断标准推荐的培养基和培养分离技术。3N培养基为双相培养基，下层为固体琼脂凝胶，结冰融化后就不能使用，只能在0℃以上保存，有效期为30天。使用3N培养基培养分离利什曼原虫，在亚洲黑热病疫区，黑热病患者的利什曼原虫的检出率不到20%；在荒漠型黑热病疫区，黑热病患者的利什曼原虫检出率不到1%，出结果时间长达15天。

发明内容

本发明提供了一种利什曼原虫液体培养基及其制备方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决使用3N培养基培养分离利什曼原虫的检出率低、检测出结果时间长和有效期短的问题。

本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种利什曼原虫液体培养基，该利什曼原虫液体培养基含有NaCl 8.5g、KCl 0.4g、NaHCO₃ 1.6g、KH₂PO₃ 0.2g、CaCl₂ 0.2g、葡萄糖5.0g、L-谷氨酰胺 0.1g、Hepes 4.5g、RPMI-1640 10.4g、小牛血清200 ml、去离子水1700ml、青霉素100万单位、链霉素100万单位、兔溶血液100 ml；该利什曼原虫液体培养基按下述步骤得到：第一步，依次将上述所需要量的NaCl、KCl、NaHCO₃、KH₂PO₃、CaCl₂、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混匀于上述所需要量的去离子水中，用0.1Mol/L的NaOH溶液调节pH至7.2，加入上述所需要量的Hepes、RPMI-1640和小牛血清混匀；第二步，将充气管插入到液体下部，用充气管充注CO₂气体到液体中，直至液体颜色由淡红色变为亮黄色，此时CO₂气体在液体中达到饱和；第三步，加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和链霉素充分混匀；第四步，将充分混匀后的液体放在除菌过滤器中用压力为0.4公斤/cm²的CO₂气体压滤除菌后得到利什曼原虫液体培养基，然后将利什曼原虫液体培养基分装到灭菌塑料瓶或玻璃瓶中，密闭，-20^OC保存。

下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进：

上述兔溶血液按下述步骤得到：第一步，选1.3Kg至1.5Kg的雌兔，无菌采血，玻珠法脱纤维，按脱纤维之后血量体积的2倍加去离子水，在温度为-5℃至5℃之间反复冻溶至血红细胞破裂，然后在离心机中4000g离心20分钟，弃沉淀，上清液即为兔溶血液。