[发明专利]一种检测CYP3A4*4基因分型的焦磷酸测序试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及体外核酸检测领域，具体涉及一种检测CYP3A4*4基因分型的焦磷酸测序试剂盒。

背景技术

CYP3A4基因的全称叫做细胞色素P450同工酶3A4，细胞色素P450（Cytochrome  P450，CYP450）是一组含有亚铁血红素蛋白酶系，又称混合功能单加氧酶系统。它主要存在于人类肝脏，对外源物处置以及内源物代谢起重要作用。已发现与药物代谢密切相关的CYP450主要有CYP1～4，其中以CYP3A4亚族最为重要，占人肝脏CYP450总量的30%，主要成员包括CYP3A3、3A4、3A5和3A7，成人肝脏中以3A4为主。

CYP3A4参与的药物代谢的种类很多，临床上50%以上的药物代谢都是通过CYP3A4，主要有：多西他赛（docetaxel）、紫杉醇（paclitaxel）、依托泊苷（etoposide）、伊立替康（irino-tecan）、伊马替尼（imatinib）、长春瑞宾（vinorelbine）、长春碱（vinblastine）、长春新碱（vincristine）等等。编码CYP3A4蛋白的CYP3A4基因位于染色体7q21.3～22.1，它包含13个外显子和12个内含子的编码区域，长约27kb。自1998年以来，国外学者陆续报道CYP3A4基因存在多态性，根据近几年中国的研究文献报道，在中国人群中被普遍关注的是CYP3A4*4基因，在这个基因中存在一个有意义的SNP位点（A13871G，I118V），这个点突变主要是一个单碱基突变，突变导致118为氨基酸从异亮氨酸变为颉氨酸。这个改变使得代谢酶的活性降低，减弱了个体对依托泊苷/替尼泊苷药物代谢能力，增强其毒副作用。根据卫生部最新的《医疗检测项目服务管理规范》中，在个体化医疗项目中，就明确提到了检测CYP3A4的意义。

目前医院用于CYP3A4*4基因分型检测的“金标准”是PCR-直接测序法, 但直接测序法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20%以上的肿瘤组织，对于含<10%突变细胞的肿瘤组织以及外周血，常规PCR+直接测序法几乎无能为力。相比于直接测序法，焦磷酸测序的灵敏性更高、成本更低。

焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基于聚合原理的DNA测序（确定DNA中核苷酸的顺序）方法，是新一代DNA序列分析技术。它是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP,若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP,继续DNA链的合成。通过分析岀峰情况，达到测定DNA序列的目的。

目前市场上还没有利用焦磷酸技术进行CYP3A4*4的基因多态性检测的产品。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种特异性高、成本低、定量、准确检测CYP3A4*4的基因分型的试剂盒。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为： 

所述检测CYP3A4*4基因分型的焦磷酸测序试剂盒中包括如下引物：

正向扩增引物：5’-GTCCAGTGGGATTTATGAAAAGTG-3’（SEQ ID NO.1）；

反向扩增引物：5’-TTCCATTCTTCATCCTCAGCTATA-3’（SEQ ID NO.2）；

测序引物：5’-TTCATCCTCAGCTATAGAGA-3’（SEQ ID NO.3）；

其中，正向扩增引物或反向扩增引物中的任意一条引物的5’端进行生物素标记。

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。

    进一步地，所述试剂盒中还包括质控品TAYGGTTTGCA（SEQ ID NO.4）（control oligo）和作为空白对照品的超纯水；质控序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核苷酸链，用于检测PyroMark Q24 测序仪的各项性能指标。

进一步地，所示试剂盒中还包括由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，以及由5'-磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物。

进一步地，所述试剂盒中还包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：