[发明专利]哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的设计、合成方法，及其在含羧基化合物的质谱分析的应用。特别是结合液相色谱质谱和基质辅助激光解析质谱的方法，实现快速、高效、准确的质谱分析，为高通量的研究羧基化合物提供了良好的手段，更为诊断医学中生物标志物的质谱分析提供了一种策略。 

技术背景

诊断医学研究中的重要课题之一就是发现及监测人类疾病的新参数——生物标志物（biomarker）（参见J.Clin.Pharmacol.2003,43,329.）。对于疾病研究，生物标志物一般是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生物标志物已经成为目前研究的一个重要热点。含羧基化合物在制药工业，生物医学领域，包括体内代谢通路上都扮演了非常重要的角色（参见Anal.Chem.1977,49,442.），对于这些物质在生物标志物领域的研究正越来越多的被关注，且成为热点。脂肪酸类化合物如亚油酸、亚麻酸、EPA、DHA、花生四烯酸等作为一大类含羧基化合物是人体内和自然界中重要的代谢物，与多种代谢酶的功能相关。这些化合物的含量变化与人体内代谢紊乱有很大的关联，例如，肥胖，糖尿病、代谢紊乱综合症等多种疾病相关（参 见Biochem.J.2011,435,723.Nature 2006,444(7121),840.Diabetes 2002,51(1),7.Lipids Health Dis.2011,10,82.Diabetes 2010,1(3),68.）。因此，对生物样本（如血浆，尿液）中脂肪酸类化合物进行定性和定量分析对研究许多生理变化和疾病诊断有非常重要的作用。 

以往多是采用先衍生化后气相色谱分析的方法，并按照峰面积归一化的方法进行定量分析该类物质。在商品化的试剂当中多是采用甲酯化和硅烷化等试剂，不仅标记试剂的反应活性较低而且准确性欠佳。此外，随着待测物分子量的增加，挥发性也逐渐下降，检测的灵敏度也不同程度的下降。所以，近年来逐渐有一些基于液相色谱质谱标记后分析该类化合物的报道（参见Anal.Chem.2007,79,5150.Anal.Chem.2010,82,6790.Anal.Chem.2011,83,3192.），但这些试剂均有着其固有的缺点，例如标记时间较长，背景残留严重，标记选择性差（与羟基也反应），灵敏度低，从而影响目标化合物的检测。而且这些试剂只能修饰一种类型的基团，能够适用的待测物有限，从而使其应用领域非常狭窄。这些局限性都促使了新的标记方法的发展和应用。 

此外，肽类和蛋白质类物质是人体内非常重要的含羧基的内源性生物活性物质，也是重要的生物标志物。它涉及激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统器官和细胞。其代谢水平与人体众多生理活动相关，检测这一类物质对于心脑血管等疾病的临床诊断具有重要意义，发展高灵敏度、高准确性的分析方法来检测肽类物质一直是科研工作者研究的热点和难点。在诊断医学研究中，许多肽类物质由于其微弱的含量以及较弱的质谱响应使得他们很难被定性定量检测到。如果能够将多肽和蛋白质中影响质谱正离子检测模式的羧基封闭，再标记上能够显著提高质谱信号的物质，则能够很好的提高该类大分子化合物的质谱响应，在未来的诊断医学研究中将发挥其巨大的潜力。 

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种哌嗪基嘧啶类同位素标记试剂的用途,用于上述试剂的脂肪酸等化合物和多肽蛋白质分析方法，尤其是用于质谱分析。 

本发明涉及到的这种同位素标记试剂化学名为[d₀]-或[d₆]-2，4-二甲氧基-6-哌嗪基嘧啶，（简写为[d₀]-/[d₆]-DMPP），其结构如下： 

A是氨基部分，它是同位素标记的活性部位，可以在缩合剂EDCI的催化下专一性的与脂肪酸和多肽等分子的羧基反应，此外该基团也是提高羧基质谱响应的重要基团。 

B是嘧啶环部分，将此芳香含氮杂环结构引入含羧基化合物的分子中，可以提高被分析物在质谱中的离子化效率，在离子化过程中更容易加合质子，从而起到提高质谱信号强度的作用。