[发明专利]一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺

说明书

技术领域

本发明涉及骨软骨组织工程支架的制备技术领域，具体涉及一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺。 

背景技术

关节软骨由单一的软骨细胞、致密胶原和糖蛋白间质构成，主要功能是在关节间分散与传递负荷，减少摩擦，使关节可以进行光滑、无痛的活动。关节软骨无血管、淋巴管及神经支配，软骨细胞是终末分化细胞，因此软骨的自我修复能力差，各种损伤、炎症和退变均可引起不可逆性软骨损伤，严重影响关节功能和生活质量。 

目前应用于临床的修复方法均有明显的各自缺陷，修复后的软骨组织无论在生物学还是生物力学上都与天然软骨不同，且极易发生软化退变，导致疗效下降。近年来，组织工程的进步为软骨损伤的修复提供了一个颇具前景的新方法。 

组织工程的三大要素是：支架材料、种子细胞、生长因子。其中，支架材料在组织工程中起着至关重要的作用，它扮演着临时细胞外基质的角色，为细胞的黏附、生长、增殖提供三维几何环境，也使细胞能有效地进行新陈代谢。因此，寻找合适的材料，并制备结构接近天然组织的支架是组织工程成功的关键因素之一。 

用于软骨组织工程的支架厚度大致可分为两种：一是将支架的厚度控制在软骨层内，即单纯的软骨支架；另一种是将支架的厚度深入 到软骨下骨，成为骨软骨（osteochondral）组织工程支架。后一种方法可利用软骨下骨层的支架提供稳定性，使得植入物不用缝合或胶粘而方便固定，利于临床操作。最近对于骨软骨缺损模型的研究还表明，保持软骨下骨的存在会使其上软骨层中的软骨细胞获得更类似于正常关节软骨的营养与代谢环境，因此可使软骨的修复效果更好。近些年来，国内外已陆续出现不少有关骨软骨组织工程支架的报道，但是这些支架都只是在材料种类或成分比例上将骨层和软骨层的支架区分开来，而在支架的微观结构上并没有考虑天然组织的复杂分层结构。 

实际上，天然软骨的细胞和基质形态以及相应的力学性能都随深度发生着变化，显示出分层结构，各层中的细胞形态与其周围的基质形态有很大关联。其中，辐射层为关节软骨中最厚的部分，这部分的胶原纤维垂直关节面方向走行，细胞直径大，呈柱状排列，与软骨表面垂直，这种构造有利于软骨承受压力载荷。 

近期有文献明确指出，软骨组织工程想要成功，重视软骨的分层结构是至关紧要的，便于分层结构恢复的策略可使修复软骨的功能更强。Zehbe等用电解法制备出了具有垂直取向孔道的明胶支架，在其上培养的软骨细胞可以在孔道内呈纵向排列生长。Wang等的实验证明定向微沟槽可诱导细胞取向生长，进而决定了细胞分泌的胶原纤维平行于沟槽定向排列。这些报道提示我们，把软骨支架制备成含有垂直孔道的多层结构，将可能使修复的软骨在结构与功能上都更加接近天然软骨组织。 

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺，使骨层支架具有接近天然骨组织的硬度与强度，既利于软骨组织的修复，又便于临床使用支架时的操作、固定；同时，使软骨层支架具有含垂直孔道的多层结构，便于引导支架上细胞以接近天然软骨分层结构的状态生长，提高软骨损伤修复的效果。 

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的： 

一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺，包括以下步骤： 

步骤一，在质量浓度1-2%的醋酸溶液中加入壳聚糖和胶原粉末，混合搅拌，胶原与壳聚糖为任意比例混合，配置出胶原和壳聚糖混合物与醋酸水溶液的比例为1-4g：100ml的溶液，置于4℃冰箱中保存待用； 

步骤二，将聚乳酸（PLA）溶于1,4二氧六环溶剂中，配置出4-10%wt的PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，骨粉的加入量与PLA粉体质量相同，混合搅拌均匀，骨粉采用纳米晶磷酸钙胶原基骨修复材料； 

步骤三，取干燥的通孔聚四氟乙烯模具，用与通孔直径相同的聚四氟乙烯圆柱体从模具一端将孔洞堵住，向模具中注入制备好的PLA/骨粉溶液，置于-20℃冰箱中预冻1-24小时，或在-20℃下预冻1小时后转置于4℃环境下继续预冻24小时； 

步骤四，向预冻好的模具中加入胶原/壳聚糖溶液，高出骨材料 1-5mm，放入-20℃冰箱中预冻1-24小时，或在-20℃中冷冻1小时后再在4℃中冷藏24小时，然后在-50℃、10Pa条件下冷冻干燥72小时得到支架样品； 

步骤五，将冷冻干燥好的骨软骨双相支架从模具中取出，在敞口容器中再次于-50℃、10Pa条件下冷冻干燥3-10天，以使残留的1,4二氧六环和醋酸冰晶充分挥发。